A/Vietnam/1203/2004(H5N1)滴鼻途径感染雪貂模型

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。

去势雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月龄，500-1000克。 实验前进行血清学检查，HI方法检测H1N1，H5N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。

该研究项目在BSL-3实验室中进行。病毒株为H5N1A/Vietnam/1203/2004，雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒。实验的观察期为5天。皮下植入体温芯片用于监测体温、体重变化。每日观察雪貂临床症变化，在感染后第5天处死动物，取组织样本用于监测病毒复制动力曲线和动物感染后组织炎症反应检查。

雪貂感染后出现体重下降，感染后第1天一直持续到实验结束，雪貂在感染后体重下降最高达15%以上，体重变化见图1A。雪貂感染后出现体温升高，与感染前比较体温最高上升2℃。感染后第2天出现体温升高，一直持续到实验结束（感染后第5天），体温变化见图1B。

图1.雪貂感染后体重变化率%(A)；体温变化℃（B）。体重变化率%=（当天体重-0天体重）/0天体重*100%

雪貂感染然后显著的临床症状变化，根据其表现设立了评分标准：NIH提供的雪貂感染实验观察指标分为鼻部症状和活动度两个部分，具体指标见表1。

雪貂感染后出现以活动度下降为主临床改变，即表现为不活跃、对外界刺激的反应性下降，上呼吸道感染的症状如，打喷嚏、流鼻涕、呼吸困难等表现。感染后第5天1只雪貂死亡，被感染雪貂死亡前临床没有出现骤然体温升高、呼吸急促、呼吸困难等症状。雪貂感染后临床变化情况见图2。

表1 雪貂感染后临床评分标准：

图2 雪貂感染后临床表现评分（分）

2 感染雪貂组织病理损伤检查

雪貂感染H5N1禽流感病毒第5天后肺组织大体呈现多个肺叶腹侧面和背侧面出现片状灶状的坏死灶和出血灶，其他组织大体观察未发现明显异常。镜下观察发现肺组织呈炎性充血、出血、水肿、坏死、渗出的重度肺炎病理改变。大脑组织可见局灶性脑炎，血管周围炎细胞呈“套袖”装浸润，可见小灶状坏死。免疫组化染色可以观察到，尽管小肠组织没有观察到病变，在肺组织、脑组织、小肠组织均可以看到被病毒感染的阳性细胞，见图3。

图3. 感染H5N1雪貂的肺、大脑及小肠的组织病理学改变

对照组动物的肺（A）、大脑（D）、小肠（G）未见异常。感染组动物肺脏呈重度渗出坏死性肺炎改变，大量炎细胞、水肿液广泛渗出，可见坏死出血灶（B）；大脑组织可见局灶性脑炎，血管周围炎细胞呈“套袖”装浸润，可见小灶状坏死（E）；小肠组织未见异常（H）。免疫组化显示感染动物的肺（C）、大脑（F）、小肠（I）均可见大量感染病毒的细胞。A、B、D、E、G、H：HE×100；C、F、I：IHC×200

3 感染雪貂组织中病毒复制动力曲线

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活检物做病毒滴度测定，结果显示雪貂在感染后第1-5天都检测到病毒，病毒滴度为102.3-103.8TCID50。病毒滴度检测表明雪貂在感染后上呼吸道呈持续复制趋势。上呼吸道病毒复制结果见表2。

雪貂在感染后第5天安乐处死，取雪貂气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织做病毒滴度测定。结果显示各个组织都能够分离到病毒，其中以气管和肺组织的病毒滴度最高，病毒分离的阳性率为13/24。以上的结果反映了H5N1病毒感染雪貂，呼吸系统的器官是病毒侵袭的重要对象，呼吸系统以外的器官也会受到病毒的攻击，并且病毒可以突破血脑屏障感染脑组织，这就解释了为什么感染禽流感病毒病人会出现多系统多器官受损和出现神经系统的症状。各组织脏器病毒滴度结果见表3。

表2 雪貂感染后鼻甲骨活检物病毒培养滴度情况：单位：log10TCID50

-结果阴性，/动物死亡

表3 雪貂感染后组织病毒培养滴度情况：单位：log10TCID50