Western Blotting检测服务

WB技术服务简介：

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
WB技术操作步骤：

1、样品准备

1）分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状，按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)和100ul 10mg/ml PMSF，混匀，玻璃匀浆器冰点匀浆；

2）4℃，12000rpm离心10min；

3）取上清夜-70℃冻存24hr；

4）4℃ 12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。

2、定蛋白及计算电泳上样量

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug

3、电泳

1）安装好电泳装置；

2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)；

3）30min后，待凝后倾去封液；

4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干；

5）上样：各样品取50ug上样，marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)；

6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳；

7）当指示剂距平板底端25px处时停止电泳；

4、转膜及检测

1）准备2个300px的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min；

2）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min；

3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）；

4）完全排除气泡，4℃，100mA转膜2h；

5）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右；

6）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭,4℃过夜；

7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗；

8）37℃摇床孵育约2h；

9）PBST洗涤4次，每次5min；

10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min；

11）PBST洗涤4次，每次5min；

12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室温孵育30min；

13）取出NC膜，用蒸馏水漂洗后晾干；

14）扫描及分析。