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雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显,受体分布与人极为接近,是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感,病毒不经适应即能使雪貂致病,并易传播给雪貂和人。在自然条件下,雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒,其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外,对禽流感、猪流感病毒也十分敏感,且感染后出现典型症状。
分子生物学研究显示,这是由于雪貂的呼吸道上皮细胞表面存在人流感病毒特异性受体α2,6糖键连接的唾液酸,而其肺泡上皮细胞表面也存在着禽流感病毒特异性受体α2,3糖键连接的唾液酸。
概括起来,相较于其他流感动物模型,雪貂的优势为 :(1)雪貂感染流感病毒后的症状、发病机制和免疫反应与人类极为相似。(2)人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂,这为在完全控制的群体内观察流感的传播规律和流感病毒抗原性的漂移和转变提供了可能。(3)雪貂的气管较长,这样就使其上、下呼吸道区室化,有利于研究流感病毒对呼吸道不同区域的效应差异。(4)雪貂作为动物模型比啮齿类大,易于监测其体温、脉搏和呼吸频率。(5)在小型动物中,雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出现发热反应的动物模型。基于此,目前雪貂作为理想的流感动物模型已被广泛应用于流感发病机理等各方面的研究,为人类流感研究做出了重要贡献。
去势雪貂(Mustela Pulourius Furo),4-10月龄,500-1000克。实验前进行血清学检查,HI方法检测血清H7N9、H1N1、H5N1抗体,抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。
病毒株为A/Anhui/1/2013 (H7N9),经血凝抑制(HI)实验,筛选出6月龄以下对当下流行的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9亚型流感病毒相应血清抗体均为阴性的去势雪貂。为了使动物适应并降低应激反应,所有雪貂均在感染前一周进行体温芯片的皮下植入和实验室适应(使用扫描仪监测体温,BMDS, USA)。感染组通过肌肉注射盐酸塞拉嗪对雪貂进行麻醉,轻度麻醉后感染组每只雪貂经鼻接种病毒。在感染组旁边设置传播组,感染组在感染24小时后放入传播笼中传播组的邻近笼。感染组和传播组于感染(合笼)后第0-14天连续测量体温、体重并记录临床症状以进行评分;在接种(合笼)病毒1d后,每天收集鼻甲骨活检物(鼻拭子)标本,进行病毒分离和载量测定;感染后第5天感染雪貂安乐处死,尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织,进行病毒滴度测定和组织病理学检查。
雪貂在实验前1周测正常体温和体重,确定正常值,感染组雪貂在H7N9病毒接种的第1~2天使体温升高,体温升高0.5~2℃,体温升高持续3天左右,临床无死亡现象。雪貂感染后出现流涕、打喷嚏、呼吸困难、摄食减少、精神萎靡、活动度下降,对外界刺激无反应等临床表现。传播组雪貂在合笼后第11天开始出现较明显的体重下降,体温无明显变化,有雪貂出现流涕、喷嚏的现象。
图1H7N9感染与传播组雪貂体重变化率图2 雪貂感染H7N9病毒后的体温变化情况图3H7N9感染与传播组雪貂临床评分
病毒感染雪貂后第1天到第5天,用RT-qPCR方法可从鼻甲骨活检物(鼻拭子)中检测到病毒载量。从雪貂的鼻甲骨标本、肺组织标本中,经MDCK细胞培养,接种细胞产生典型细胞病变(CPE),提示病毒感染了雪貂并由病毒的复制和排毒,鼻甲骨标本分离阳性的高峰期在1~5天。传播组1/3雪貂合笼后5-7天在鼻拭子中检测到病毒。感染组解剖雪貂可在鼻甲、气管、肺、肾、肠、眼组织中分离到活病毒,此结果证明H7N9病毒可以在呼吸道以外的组织气管中复制、繁殖。用HA方法可证实MDCK细胞有H7N9抗原存在。
图4H7N9感染与传播组雪貂鼻拭子病毒滴度
3. 雪貂模型感染后血清特异性抗体产生情况
在H7N9病毒接种前和接种后第5天安乐时,经静脉采血1mL分离血清,检测血清中H7N9病毒特异性抗体。感染组雪貂在5天安乐死时,均为阴性;在21天取血时,均为阳性。传播组雪貂在合笼第21天血清中抗体检测为阳性。
表1H7N9感染与传播组雪貂血清抗体水平
Table1TheantibodylevelofH7N9 infectedand exposed ferrets
血清抗体水平
3d
5d
7d
21d
血凝抑制(HI)抗体
感染组
-
+
传播组
微量血清中和
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