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| 标识符 | CSTR:16397.09.0C01000786 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 资源中文名称 | H7N9禽流感雪貂模型 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 资源英文名称 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 疾病概述 | 2013 年3 月31 日，依据《国际卫生条例（2005）》，中国政府报告上海和安徽发现3 例人感染新型甲型H7N9 禽流感病毒（以下简称H7N9）病例。在随后的几个月内，以华东地区为代表的我国多个省市陆续确诊并报道多例H7N9禽流感病毒感染人造成重症肺炎甚至死亡的病例，这是世界首次发现的新型重配H7N9禽流感病毒所致的人感染疫情，引起了全球广泛关注。 H7N9禽流感病毒是由H7 的HA 基因，N9 的NA 基因以及H9N2 病毒的6 个内部基因片段重配而成的新型病毒。对目前已公布了全基因组的若干H7N9禽流感患者分离株的序列分析结果显示，该病毒具有与之前其他亚型甲型流感病毒类似的遗传特征，包括对禽类低致病性，感染哺乳动物的能力增强，对金刚烷胺类抗病毒药物耐药，以及对神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦和扎那米韦）敏感。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 实验动物背景信息 |
雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。 分子生物学研究显示，这是由于雪貂的呼吸道上皮细胞表面存在人流感病毒特异性受体α2,6糖键连接的唾液酸，而其肺泡上皮细胞表面也存在着禽流感病毒特异性受体α2,3糖键连接的唾液酸。 概括起来，相较于其他流感动物模型，雪貂的优势为 ：（1）雪貂感染流感病毒后的症状、发病机制和免疫反应与人类极为相似。（2）人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂，这为在完全控制的群体内观察流感的传播规律和流感病毒抗原性的漂移和转变提供了可能。（3）雪貂的气管较长，这样就使其上、下呼吸道区室化，有利于研究流感病毒对呼吸道不同区域的效应差异。（4）雪貂作为动物模型比啮齿类大，易于监测其体温、脉搏和呼吸频率。（5）在小型动物中，雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出现发热反应的动物模型。基于此，目前雪貂作为理想的流感动物模型已被广泛应用于流感发病机理等各方面的研究，为人类流感研究做出了重要贡献。 去势雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月龄，500-1000克。实验前进行血清学检查，HI方法检测血清H7N9、H1N1、H5N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。 |
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| 模型制作方法 |
病毒株为A/Anhui/1/2013 (H7N9)，雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染H7N9病毒。实验的观察期为14天。皮下植入体温芯片用于监测体温、体重变化。每日观察雪貂临床症变化，在感染后第5天处死动物，取组织样本用于监测病毒复制动力曲线和动物感染后组织炎症反应检查。 |
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| 模型表型数据 |
1.雪貂模型感染后临床症状变化
雪貂感染H7N9病毒后出现典型临床症状，包括体温升高（图1）、体重降低（图2）、流涕（图3 (i)）、活动度降低（图3 (ii)）、食欲下降等等。其中接种108TCID50病毒的雪貂，体温升高及体重下降的峰值分别出现在感染后第2天和第7天，达40.0℃及10.7%；而接种106TCID50病毒的雪貂，相应的峰值则出现在第4天和第5天，分别达40.1℃及9.3% （图1、图2、表1）。 图1雪貂感染H7N9病毒后的体温变化情况。 图2雪貂感染H7N9病毒后的体重变化情况。 图3 雪貂感染H7N9病毒后的临床症状及肺组织大体解剖情况。 (i&ii)临床表现；(iii)肺组织大体解剖观察。
表1 雪貂感染H7N9病毒后的临床表现
a出现该临床表现的动物数量占总观察数量的比例。. b感染108TCID50H7N9病毒的雪貂体重下降峰值为10.7% ，而感染106TCID50H7N9病毒的雪貂体重下降峰值为9.3%。
2.雪貂模型感染后病毒在组织中复制情况
感染雪貂的上呼吸道排毒始于感染后第1天，并持续至第7天，感染108TCID50或106TCID50病毒雪貂的排毒峰值分别分离自第3天的咽拭子（104.38TCID50/ml）以及第5天的鼻拭子（104.11TCID50/ml）（图4）。感染后第3天，H7N9病毒可从全部2只被解剖雪貂的肺、气管、嗅球，以及1只雪貂的心脏JianCe出，而至感染后第7天，全部2只被解剖雪貂的气管和肺，以及1只雪貂的肝均可检测到H7N9病毒的存在（表2）。 图4 雪貂感染H7N9病毒后的支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织携带的病毒滴度。* P<0.05.
表2 雪貂感染H7N9病毒后各组织病毒复制情况
3、雪貂模型感染后组织病理损伤及肺部影像学检测
接种106TCID50病毒的雪貂，在感染后第3天和第7天各安乐2只，进行病毒的组织分布和病理观察检测。大体解剖结果发现，感染后第3天和第7天，所有解剖雪貂的肺组织均出现多点病灶（图3 (iii)），但雪貂的脑、心脏、肝、脾、肾、胃、小肠、嗅球等均未发现肉眼可见病变。H-E染色结果证实，感染后第3天，雪貂肺组织表现局灶性中度间质性肺炎、肺泡腔内纤维素及炎细胞渗出等；而至感染后第7天，肺部病变范围进一步扩大，并出现重度间质性肺炎（图5 (iii-iv)）。免疫组化的结果证实H7N9病毒阳性抗原主要分布于感染雪貂的支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞（图5 (i-ii)） 图5雪貂感染H7N9病毒后的各组织切片H-E染色和免疫组化分析。
感染108TCID50病毒的雪貂每天进行胸腔显微CT扫描，来动态观察雪貂肺部的病变进程，结果显示感染后6-14天雪貂的右上肺叶逐渐出现轻度至双边毛玻璃样阴影的炎性损伤（图6）。 图6雪貂感染H7N9病毒后胸腔显微CT扫描成像，圆圈及箭头指向的是炎性损伤部位。
4. 雪貂模型感染后血清特异性抗体产生情况 感染后第14天，对雪貂进行心脏采血以及血凝抑制实验（HI），测定对H7N9病毒的特异性抗体效价，结果证实所有接种雪貂均出现抗体转阳现象，HI效价高达160-1280。
5. 雪貂模型感染后血常规检测结果 临床研究证实，患者感染H7N9病毒后，会出现显著的白血球减少症。在雪貂模型中，我们同样观察到这一现象。与小鼠感染前相比，感染后第7天，雪貂模型出现显著降低的白细胞总数和淋巴细胞数，以及显著升高的中性粒细胞数(P<0.05，表3)。 表3. 雪貂感染H7N9病毒后均出现白血球减少症。
a白细胞总数，表示为每微升外周血中103白细胞数量。 bLY；淋巴细胞，NE：中性粒细胞，数值为6只小鼠的平均值。 c-1天：感染H7N9前一天基础数值。 *相较-1天结果，P<0.05. /
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