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| 标识符 | CSTR:16397.09.0I01000712 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 资源中文名称 | IFITM6敲除小鼠_ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 资源英文名称 | IFITM6 gene knockout mice | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 疾病概述 | 固有免疫是机体防御外来病毒感染的第一道防线，通过识别病原并产生各种细胞因子、趋化因子、干扰素（IFN）等多种抗病毒因子。干扰素诱导的跨膜蛋白（IFITM家族），是一类具有抗病毒作用的ISG（干扰素诱导基因）的编码产物，并证明其在多种生物过程中发挥作用，具有广泛的抗病毒作用，并在免疫信号转导、细胞归巢等发挥作用。 IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特异性表达与骨细胞，不依赖与IFN的表达，其余家族在IFN的调控下在多组织和器官广泛表达。其中，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人类中表达，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表达（图1）。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 实验动物背景信息 |
实验所用小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也被称为C57 black 6，也称作B6。1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。主要用途包括：作为生理学与病理学的实验动物模型、构建转基因动物模型、作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系。该品系在国内使用频率高，价格相对便宜。 |
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| 模型制作方法 |
3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 C57BL/6购自北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠数量10-15只，年龄3周龄，交配传代用野生型鼠为成年8-10周龄小鼠。实验中基因工程小鼠由本实验室繁殖产生。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18004.
3.1.2实验仪器
3.1.3实验试剂
3.1.4模型构建流程 利用CRISPR/Cas9技术制备IFITM6敲除小鼠。选择敲除第二外显子，来构建IFITM6敲除小鼠(B6.IFITM6(tm)-GC/ILAS)。该基因敲除的杂合子小鼠，相互杂交可以获得该基因敲除的纯合子小鼠，使用PCR方法进行基因型鉴定。 3.1.5 IFITM6敲除小鼠的建立 3.1.5.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立 （1）设计方案
图 1.IFITM6敲除小鼠模型构建设计方案 （2）构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。
靶点1: M- Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG M- Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT
靶点2: M- Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC M- Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 （3）构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
（4）显微注射
1）超数排卵：10-15只3周龄雌鼠注射激素进行超排。
2）受精卵注射：取约120枚受精卵进行注射。
3）受体鼠制备：8-10周龄雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
4）胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，120枚卵，5只受体鼠）。
（5）基因型鉴定
1）剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
2）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
3）PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。
（6）结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
（7）根据测序结果确定IFITM6敲除小鼠模型(B6.IFITM6(tm)-GC/ILAS)用于后续实验。
3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析 获得F0代后，首先通过与野生型鼠进行杂交，进行基因修饰鼠传代能力分析。获得能够传代的杂合子小鼠进行相互杂交，产生纯合敲除小鼠并用于后续实验。 图2. IFITM6敲除小鼠的繁育
3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒（全式金）说明书按以下程序操作。 （1）加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
（2）12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
（3）加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
（4）将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
（5）加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
（6）重复步骤（5）一次。
（7）加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
（8）重复步骤（7）一次。
（9）10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。
（10）将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。
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