细胞转染实验

实验介绍

转染－即把核酸导入细胞，已经成为当前生命科学研究中基本操作之一，转染方法有多种，包括介质介导和电穿孔，其中介质又有早期的磷酸钙法，脂质体法和病毒介导。目前使用最广泛的是脂质体介导法，有很多商品化转染试剂可供选择，很多公司，包括国内研究人员耳熟能详的Invitrogen、Roche、Qiagen、Novagen等等都开发生产了转染试剂，它们也的确帮助了多数研究者完成了转染实验。转染的关键是高转染效率和低细胞毒性，即把核酸转入尽可能多的细胞，又要使转染了核酸的细胞尽可能多地存活，且没有发生分化。

实验仪器

细胞培养皿、转染试剂盒、离心机、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、PCR仪、蛋白质电泳系统、冷冻离心机、热冲击仪、电穿孔仪。

实验方法

脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2～24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 

操作步骤[方法一]： 

(1) 取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1～2×10 个液，37℃CO2培养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 

(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL。B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 

(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。 

(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 

(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。 

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：

(1) 以5×10⁵细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。 

(2) 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下： ① 在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。 ② 旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。 ③ 室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。 

(3) 弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。 

(4) 再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14～24小时。

(5) 吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 

稳定的脂质体转染方法如下： 

(1) 接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。 

(2) DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。 

(3) 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。 

(4) 吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞筛选法进行。