三转基因银屑病小鼠模型

　　银屑病是人类特有的一类疾病，在动物中少见，银屑病动物模型的制作主要采用化学制剂诱导，基因修饰或组织移植等方式制备，可以在一定程度上模拟银屑癣的病理表型、慢性炎症等，但是各有优缺点。信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是STAT转录因子家族的一员，STAT3参与皮肤伤口的愈合、角质细胞迁移、毛囊生长、抵抗皮肤的放射损伤等，皮肤转基因表达活化的STAT3可引发类似银屑病的病变，而抑制STAT3表达可以改善银屑病症状；尿激酶型纤溶酶激活剂（Plasminogen activator, urokinase，PLAU）是多种血纤维蛋白溶酶原的激活因子，PLAU 和PLAU受体（Plasminogen activator, urokinase receptor，PLAUR，）也叫做UPAR或CD87，都在皮肤组织表达，PLAU/PLAUR表达升高可能是银屑病发生的重要原因。利用转基因技术，将STAT3、PLAU和PLAUR同时转入小鼠基因组，建立皮肤特异表达三种基因的转基因小鼠，小鼠表现毛囊发育异常、表皮过度增生和慢性炎症，可以作为多病因综合小鼠银屑病。

　　用PCR的方法克隆人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三种基因的开放阅读框，均插入表皮特异性表达启动子下游构建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三种表达载体。用显微注射法将三种混合后的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制备三转基因银屑病小鼠。

（一）三转基因小鼠基因型

　　用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入到假孕受体ICR小鼠中，小鼠出生后9-14d提取基因组DNA，用PCR扩增目的基因片段来检测转基因小鼠，三种目的基因片段分别为PLAU基因545bp，PLAUR基因475bp，STAT3基因550bp（图1）。

图1PCR鉴定转基因小鼠基因型

注：P：阳性对照；N：阴性对照；W：空白对照；M：DNA相对分子质量标记；1、4、7是F0代阳性转基因小鼠；2、3、5、6、8是F0代阴性小鼠。

（二）人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三种基因的表达

　　首先用Western blot 分析1月龄的转基因小鼠皮肤中人PLAU，PLAUR及鼠STAT3的表达情况，结果显示三种蛋白在皮肤中均有表达，表达量各有差别（图2）。

图2三种基因在转基因小鼠皮肤中的表达

注：WT：野生型小鼠；TG1、TG4、TG7：转基因小鼠；内参：β-actin。

（三）转基因小鼠与同龄野生型小鼠表皮差异

　　Western blot 结果显示TG4皮肤中主要高表达PLAU和STAT3，而TG7皮肤中PLAU，PLAUR和STAT3均高表达。和TG4小鼠比较TG7小鼠表型更明显，说明三种基因同时表达对病理发生是关键。TG7小鼠在1月龄就表现腹部毛发稀疏，无光泽，表皮粗糙，至4月龄表现典型腹部皮肤红肿和炎症（图3）。皮肤炎症主要表现在腹部，背部表型不明显。除皮炎表型外，小鼠生育和发育无异常。

图3转基因小鼠表皮表型

（四）皮肤病理表型

　　选用4月龄的转基因阳性和同龄野生小鼠，取背部及腹部皮肤，HE染色，镜下观察显示，转基因小鼠真皮变簿（图4A），表皮过度角化和棘层增厚（图4B），毛囊减少和发育异常，部分毛囊内未见毛干（图4C），角化不全区域内可见中性白细胞构成的小脓肿（Munro氏小脓肿）和真皮炎细胞浸润（（图4D）。

图4 病理观察

注：对4月龄野生型小鼠（WT）和三转基因基因小鼠（TG7）的腹部皮肤进行H&E染色和病理观察，显示转基因小鼠真皮变薄（A，白色箭头所示），表皮过度角化（B，黑色箭头所示）和棘层增厚（B，黄色箭头所示），毛囊减少和发育异常（C，红色箭头所示），出现Munro氏小脓肿（D，绿色箭头所示）和真皮炎细胞浸润（D，蓝色箭头所示）。