高血压相关的G蛋白偶联受体激酶4转基因小鼠模型

　　多巴胺和肾素-血管紧张素系统是两个最主要的血压调控途径，二者与细胞间第二信使系统协同调节体内水钠平衡，GRK4（G蛋白偶联受体激酶4G-protein-coupled receptor kinase 4, GRK4）则在多巴胺介导的尿钠排泄中发挥重要的作用。GRK4是唯一有4个剪接变异体（GRK4α,β, γ和δ）的GRKs家族成员，编码GRK4的基因定位4p16.3，该位点已被证实与高血压的发生相关。GRK4的突变与肾脏促尿钠排泄功能受损和高血压的发生密切相关，其中R65L（rs2960306）、A142V（rs1024323）和A486V（rs1801058）是现阶段研究频率较高的三个突变。在对中国北方汉族人群的研究中发现，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同时存在可使高血压的发生风险较无突变人群高6倍。

　　目前建立的人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四种基因转基因小鼠，对其进行血压动态对比分析。结果发现，GRK4γ野生型和GRK4γR65L突变转基因小鼠血压正常；GRK4γA142V突变转基因小鼠在正常的钠盐摄入情况下即可发生高血压，而GRK4γA486V突变转基因小鼠只有在增加钠盐摄入情况下才发生高血压，说明GRK4γ的不同突变会引起不同类型的高血压。

　　用PCR的方法克隆人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四种基因的开放阅读框，，均插入系统性表达的启动子下游构建人GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V四种表达载体。用显微注射法将四种转基因载体分别注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制备四种转基因小鼠。

（一）GRK4γ wt/R65L/A142V/A486V 转基因小鼠基因型及表型

　　提取小鼠基因组DNA，用PCR法扩增623bp的目的片段，鉴定小鼠基因型（图1A）。提取心脏、肾脏和肾上腺组织总蛋白，用GRK4抗体进行Western Blot分析，确定转基因小鼠GRK4的高表达（图1B）。通过比较对照组（NTG）和转基因小鼠中GRK4表达水平，筛选到在心脏、肾脏和肾上腺均高表达GRK4基因的转基因小鼠品系。

图1 GRK4γ野生型基因和三种GRK4γ基因突变转基因小鼠的建立

1. PCR鉴定GRK4γ野生型基因和三种GRK4γ基因突变转基因小鼠基因型；1为空白对照；2为阴性对照；3为阳性对照；5、8、11、13为阳性转基因小鼠；4、6、7、9、10、12为阴性转基因小鼠。
2. Western Blot分析GRK4蛋白在转基因小鼠心脏、肾脏和肾上腺组织中的表达，GAPDH为内参；

（二）正常饮食GRK4γ野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析

　　NTG 和转基因阳性小鼠于2、4和8月龄进行血压动态分析。结果显示，NTG和转基因阳性小鼠平均动脉血压（mean arterial pressure, MBP）[平均动脉血压＝舒张压＋1/3（收缩压﹣舒张压）]均随着年龄的增长而增加。与NTG小鼠相比，GRK4γ野生型和GRK4γR65L转基因小鼠血压正常；GRK4γA142V转基因小鼠在8月龄时血压显著升高（P=0.009）；而GRK4γA486V转基因小鼠在正常的钠盐摄入情况下并未出现高血压表型（图2）。说明，外源性转入人源GRK4γ野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突变不会影响正常钠盐摄入情况下血压水平，而GRK4γA142V突变即使在正常钠盐摄入情况下仍会引起血压升高。

图2 正常饮食GRK4γ野生型基因和三种GRK4γ基因突变的转基因小鼠血压动态对比分析（注：*P<0.01；**P<0.01）

（三）高盐饮食GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析

　　于2月龄时将NTG和GRK4γA486V转基因小鼠随机分成四组，即NTG正常饮食组（N=8）、GRK4γA486V正常饮食组（N=5）、NTG高盐饮食组（N=6）和GRK4γA486V高盐饮食组（N=6）。正常膳食饮食组饲料中氯化钠含量为0.06%，高盐饮食组饲料中氯化钠含量为4%，连续喂养4周后恢复正常饮食，并对各组小鼠进行血压动态分析。结果显示，经过高盐饮食刺激，与正常饮食组NTG小鼠相比，高盐饮食组NTG小鼠MBP虽有所升高但无显著性差异；而高盐饮食组GRK4γA486V转基因小鼠较正常饮食组GRK4γA486V转基因小鼠MBP显著升高（P=0.0007），且MBP变化值为7.53mmHg（图3）。临床上，将因钠盐摄入量增多而导致的MBP升高值≥ 7mmHg的高血压定义为盐敏感性高血压。由此可知，GRK4γA486V突变诱导高血压属于盐敏感性高血压。

图3 高盐饮食GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析