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操作方法:
(1)颈椎脱臼法处死SD大鼠后,立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉,PBS溶液冲洗两遍。
(3)去除骨骺端,用1mL无菌注射器吸取DMEM溶液冲洗骨髓直至骨髓腔变白,吸入离心管内,1000rpm离心5min,弃上清。用PBS重悬细胞沉淀。
(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内,保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层,注意不要搅动液面,保持二者分层界面。
(5)2000rpm离心20min,离心后溶液分5层,吸取中间骨髓基质细胞层(白膜层),PBS洗3次。
(6)用含生长因子和血清(2%FBS)的EBM-2培养基以106/mL细胞浓度接种于6孔板中,置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,48h后取出未贴壁细胞继续培养。
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