富血小板血浆协同改善Beagle犬手术诱导的骨关节炎模型建立

摘要：本研究旨在探讨富含血小板血浆(PRP)和脂肪间充质干细胞(MSC)作为骨关节炎(OA)的基础治疗的临床效果。

方法：24只比格犬作交叉韧带横断模型。犬随机分为四组(n = 6)根据关节内注射材料：对照组用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，PRP组用PRP，MSC组PBS中含脂肪间充质干细胞MSC， MSC和PRP联合治疗(MP)组。

结果：采用跛行评分、局部压迫强度、关节外基质(ECM)组成、组织病理学和实时PCR技术评价PRP和脂肪间充质干细胞对犬骨关节炎的作用。按照MP、PRP和MSC组的顺序，这些都对评价类别产生了积极的影响。患侧股骨关节面软骨的跛行评分较低，局灶性压缩强度高于OA对照组。另外，当评价Mankin评分及组织形态学检查，PRP和/或脂肪间充质干细胞治疗对炎症变化均有改善。试验组对细胞外基质糖胺聚糖和胶原组成更为有利。通过上调，ECM相关基因显著增加，而PRP和脂肪间充质干细胞对软骨细胞凋亡和炎性细胞因子的抑制作用降低了炎性细胞因子的蛋白表达。

结论：总之，这项研究表明PRP和脂肪间充质干细胞治疗通过刺激ECM合成和软骨细胞增殖，抑制炎症反应对OA产生有益的影响。

背景：骨性关节炎(OA)是最常见的关节疼痛和功能障碍综合征，伴有不同程度的功能限制和生活质量下降。由于骨性关节炎大多是不可逆的、渐进性的，因而失去了软骨层。OA最理想的治疗方法是阻断软骨的分解代谢，促进正常软骨的再生。对于骨性关节炎通常集中在疼痛和不适的姑息疗法，对运动功能的改善，并防治进一步退化。临床治疗OA的主要方法包括广泛使用非甾体抗炎药、止痛剂和透明质酸，这些症状允许短暂的症状缓解，但没有明显的疾病改善作用。因此，迫切需要开发替代剂，从根本上防止软骨的破坏或刺激其适当的修复。努力寻找具有细胞来源的有效的软骨保存方法。孤立软骨细胞的扩张和植入方法被认为是根本的解决方案。培养软骨细胞的主要问题是失去产生透明软骨的特性。有报道说在犬模型中，培养的自体软骨细胞不能恢复正常的透明软骨。富血小板血浆(PRP)的定义是超过1×106细胞/微升血小板人口的等离子体，它通常比正常血浆有高四到八倍甚至更多的血小板。PRP具有多种生长因子，如血小板衍生生长因子和转化生长因子β。PRP具有血管生成、抗炎和抗分解作用。据报道，PRP中转化生长因子β和成纤维细胞生长因子对软骨有合成代谢作用。这些因子不仅调节细胞的迁移和增殖，而且通过刺激血管生成促进伤口愈合和细胞外基质重塑。在前人研究的基础上，我们推测PRP与脂肪间充质干细胞的结合对软骨再生有协同作用。本研究的目的是利用犬OA模型研究PRP和脂肪间充质干细胞在炎症过程中对关节软骨形态和再生的影响。

方法：PRP的制备：采用双自旋法制备自体PRP。收集50毫升新鲜血液，加7毫升枸橼酸葡萄糖配方A。然后，血液以1200 rpm离心10分钟，分为三层：血浆、白膜、红细胞。等离子体和血沉棕黄层被分离到一个新的管，混合物于2500 rpm离心10分钟。丢弃上清液，只留20%的血浆。收集的血浆(PRP)采用全血细胞计数检测以确保它有1×106血小板/μL或更多。制备的PRP在6小时内使用。

脂肪间充质干细胞分离培养：从犬的腹壁侧部收集约15克的脂肪组织。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)多次冲洗，以去除残留的麻醉剂和血液。37度水浴中，使用0.075% I型胶原酶消化2h,每30min消化和倒置一次。加入等体积DMEM和10%的胎牛血清后，它以1200 rpm离心10分钟。去掉上清和血脂。用PBS清洗细胞颗粒，经100μm尼龙网过滤。在相同的条件下离心后，细胞悬浮在100×20毫米的细胞培养皿中含改良低糖DMEM培养基和10%胎牛血清培养基中。24小时后，用PBS清洗非贴壁细胞和碎片，每周更换两次细胞培养基。收集和使用第1和第2段之间的脂肪间充质干细胞。建立了MSCs流式细胞仪分析，获得阴性的脂肪间充质干细胞分化群(CD)34、CD45和阳性的CD29、CD44。

犬交叉韧带切断模型：本实验选用24只健康的比格犬。狗的体重平均7.7±1.1kg，年龄2岁到3岁之间。在麻醉状态下，用11号手术刀切除右后肢的十字交叉韧带。用常规方法缝合结缔组织和皮肤。手术后给予止痛药(曲马多8毫克/公斤，皮下)和抗生素(恩诺沙星5毫克/公斤，皮下)给药3天。软组织愈合一周后，每只狗每天散步10分钟，持续2个月。然后每周给予治疗连续1个月。2个月后，处死狗，采集标本。

MSC和PRP应用：建立犬骨关节炎模型后，受试动物每星期关节内注射每组材料治疗1个月，对照组用1 ml PBS， PRP组1毫升PRP，MSC组在PBS 1 ml 含1×107脂肪间充质干细胞和MSC和PRP组(MP)在1 ml PRP含 1×107PRP。对照组犬的对侧关节囊作病理组织学检查，不给予任何处理材料。

评估：跛行评分：术前和术后每个月测量跛行评分。所有犬术前步态正常，无跛行。使用以前的评分系统，0，无明显跛行;1，轻微的横向重量转移但走路和小跑没有跛行;2、在走路时无跛行，小跑轻度跛行;3，轻度跛行，行走、小跑跛行明显;4，小跑不能承重;5，在行走和站立均不能承重。三名兽医评估了跛足程度。

局部压缩强度的测定：在处死动物和取样后，用计算机测试股骨和胫骨关节面(0.2 mm)的体外抗压强度，用N表示。测量点为股骨内侧髁和胫骨髁的中心区域。

组织学：从各组膝关节处取股骨外侧髁和胫骨髁中心区的关节软骨。他们分别固定于10%中性缓冲福尔马林(NBF)，然后在脱钙液(24.4%甲酸和0.5 N氢氧化钠)脱钙14天(混合脱钙液每天更换一次连续14天)。每个股骨和胫骨关节面软骨纵向修剪。石蜡包埋，切片(3-4μm)，天狼猩红染料染软骨组织。

ECM成分分析：各组膝关节股骨和胫骨关节软骨部分分别冻干以获得干重。然后将该片消化，用于糖胺聚糖和胶原分析。用紫外可见分光光度计测定了甲基亚甲基蓝硫酸化GAG确定GAG含量。Erlich的羟基脯氨酸含量测定胶原含量。羟脯氨酸含量转化为胶原含量使用下列方程，(μg羟脯氨酸?×?稀释因子)/ 0.13=μg胶原。人类半月板羟脯氨酸约占胶原氨基酸含量的13%.

ECM相关软骨细胞基因mrna表达: 应用实时pcr技术检测股骨和胫骨关节面软骨j监测SOX9基因和蛋白聚糖信使RNA的表达。

BrdU摄取量测量：评价MSC和PRP或其联合(MP)对犬膝关节细胞的增殖的影响，增殖的细胞由腹腔注射5-溴脱氧尿苷标记。狗腹腔注射BrdU 50毫克/公斤，溶解在生理盐水中，体积为1毫升/公斤，72小时后处死动物。对切片使用抗BrdU抗体免疫组化染色检测BrdU摄取。

免疫组织化学：用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物纯化原代抗体，观察BrdU作为细胞增殖标志物的免疫反应性。在使用间充质干细胞、PRP或结合物治疗后制备的股骨和胫骨表面软骨组织观察其对caspase-3、裂解聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α，环氧合酶(COX)2，白细胞介素(IL)- 1β干扰素(IFN)-γ，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的免疫反应。

骨组织形态计量学：观察更详细的组织病理学改变，番红O对关节软骨损伤进行染色，使用Mankin评分系统评估。得分越高，OA越严重。基于计算机的自动图像分析仪对准备好的纵向修剪样品分析股骨和胫骨关节软骨厚度。每组六个股骨和胫骨关节面区域的组织学区域被作进一步分析。超过20%的免疫反应被视为阳性。

结果：MP组跛行评分较其他组降低，组间无显著性差异。PRP组和MP组治疗后2个月、3个月的跛行评分均较治疗前明显下降。对照组股骨和胫骨关节面软骨的焦点抗压强度较假手术组显著降低。然而，三种材料的处理都显著提高了局部压缩强度。MP组的局灶性抗压强度高于其他处理组。对照组的Mankin评分与假手术组相比明显增加。与对照组相比，发现所有三个试验材料在股骨和胫骨关节软骨治疗的Mankin评分明显降低。特别是，MP治疗组犬Mankin评分最低。MSC和PRP的关节软骨厚度高于对照组。与PRP组相比，MP组对关节面的作用更为明显。对照组与假手术组相比，对照组的细胞因子含量显著降低。但与对照组相比，各治疗组均显著增加。实时PCR检测ECM相关基因、软骨聚集蛋白聚糖和Sox9基因的表达与假手术组比较降低。然而，三种试验材料对这些下调基因的表达都有显著的提高，而MP组的基因表达最强。与假手术组相比，对照组股骨和胫骨关节软骨中BrdU阳性细胞明显减少。各治疗组与对照组比较有显著性差异。MP组软骨细胞增殖明显高于MSC或PRP组。与假手术组相比，对照组Caspase-3和PARP免疫阳性细胞明显增加。然而，三种测试材料的处理都显著地减少了这些细胞的数量，而MP组的细胞减少率最为显著。对照组股骨和胫骨软骨中肿瘤坏死因子α、COX-2、IL-1β、iNOS、IFN-γ染色细胞明显增多，与假手术组比较差异显著。治疗组这些促炎细胞因子在软骨上的增加比对照组减少了。

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