耳功能损伤斑马鱼模型

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

1. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系 5 dpf 幼体。斑马鱼的位听觉器官由相当于哺乳动物内耳的耳囊及其附属结构构成，包括神经丘(有数个位于中心的毛细胞和围绕在周围的支持细胞构成)、半规管和两个耳囊（椭圆囊和圆囊，相当于人的卵圆窗和圆窗），其功能与人类内耳相同。另外，在斑马鱼侧线系统上的神经丘毛细胞也具有位觉功能。斑马鱼 5-dpf 幼体直到成年，其对声音的刺激域和频宽是不变的。因此，斑马鱼的位听觉器官是研究位听觉的理想模型。

2. 造模化合物及其对斑马鱼的处理

造模药：氨基糖苷类药物：庆大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)和链霉素(Streptomycin)。三种造模药通过预实验确定给药浓度梯度。均使用人工海水直接配置。将发育至 6 hpf 的斑马鱼胚胎暴露于上述三种氨基糖苷类药液中，直至 72 hpf。撤去药液，用正常饲养液清洗斑马鱼后，继续发育至 5、6 dpf，进行后续处理。

3. 模型分析指标

（1） 症状观察

斑马鱼身体平衡失调和体位异常与其位觉功能损伤相关。正常斑马鱼的 5 dpf幼体静止时体位为俯位。斑马鱼幼体在静止时呈斜侧位，或游动姿态异常，均为体位失衡。

（2） 毛细胞损伤检测

取野生型和造模药处理的斑马鱼幼体（6 dpf），分别浸入活体荧光染料 1 μM Yo-Pro-1（Invitrogen）的人工海水中避光孵化 1 小时，将斑马鱼用人工海水洗三 次，再将胚胎置于麻醉剂 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonate salt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉后在荧光显微镜下观察毛细胞形态、数量和排列，并拍摄、计数。

（3） 病理诊断

显微镜下观察活体幼体耳结构的变化，包括半规管和耳囊形态结构的变化。以同批野生型斑马鱼幼体为正常对照组，药物处理组撤药 2 天后，以耳石周围的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五个部位的神经丘毛细胞作为主要观察对象，结合侧线神经丘和毛细胞的观察、计数。以神经丘毛细胞数量减少和毛细胞结构异常为病理诊断指标。

（4）基因检测

RT-PCR 方法检测听觉发育基因的转录水平：

收集野生型和药物不同浓度处理胚胎各 40 枚, 用 Trizol 提取总 RNA; 以 AMV 反转酶反转录试剂盒(Promega 3 Co.) 合成 cDNA1st 模板；进行常规 PCR。以 β-actin 基因作为内参基因。PCR 产物电泳, 凝胶成像分析仪拍照记录。

1. 动物症状及病理观察

在药物处理、撤药 2 天后，以耳石周围的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五个部位的神经丘毛细胞作为主要观察对象，发现这五个部位的神经丘毛细胞均有不同数量的减少，同时侧线神经丘和毛细胞也有不同程度的减少（图 1）；此外，处理组幼体的半规管和耳石结构出现异常：卵圆囊变为圆形，而圆囊变小且不规则（图2）。另外，幼体的身体姿态静止时失衡（图 3）。这些症状均与人的位听功能损害表现相似。

图 1. 庆大霉素对毛细胞的损伤(7 dpf)

斑马鱼头部和测线排列的神经丘主要由“花瓣样”排列的数个毛细胞组成。绿色荧光点显示神经丘内的毛细胞。

图 2. 三种氨基糖苷类药物对斑马鱼半规管和耳囊结构的损伤(5 dpf)

图 3. 三种氨基糖苷类药物处理导致斑马鱼幼体(5 dpf)身体姿态失衡

三种氨基糖苷类抗生素作用于斑马鱼胚胎发育期，虽然孵化后撤除了药物，但幼体仍显现出严重的毛细胞损伤和数量减少，以及神经丘缺失和排列紊乱。说明这种耳毒性损伤难以恢复。

2. 基因表达异常

进一步检测早期听觉器官发育的四个重要基因 eya1、val、otx2、dlx6a 的表达水平，结果显示这三种氨基糖苷类抗生素导致这些基因在 48 hpf 胚胎的表达水平不同程度的下降。推测这些基因的下调可能与斑马鱼幼体内耳结构和神经丘毛 细胞发育的缺陷及听力缺陷相关（图 4）。

图 4. 三种氨基糖苷类药物处理对斑马鱼耳发育相关基因表达的影响