非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）斑马鱼模型

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

1. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 品系。

2. 造模化合物及斑马鱼处理

采用高脂、高糖、高胆固醇三种饮食方案饲喂斑马鱼幼体。具体方案见图1 （Ref.1）。主要步骤：取野生型斑马鱼幼体(5 dpf)，随机分为4组：正常饮食(30 mg/d AP100)、高胆固醇(30 mg/d AP100 plus 4% (w/w) cholesterol)、高糖(30 mg/d AP100 plus 0.25%(w/v) fructose)、高脂(180 mg/d AP100)，按照各自饮食方案饲喂10天。饲喂终止后，空腹过夜，收集幼体进行后续实验检测。为了观察胆固醇在体内的分布，在4组食物中添加BODIPY 标记的胆固醇(10μg/g cholesterylBODIPY 542/563-C11, Invitrogen)。

3. 模型分析指标

（1） 症状观察

观察和拍照斑马鱼表型；测量斑马鱼幼体体长和称重，统计学处理并比较 4组数据。

（2） 病理检测

A. 对斑马鱼整体进行油红染色，检测体内脂质蓄积水平和分布；荧光显微镜下观察 BODIPY 标记的胆固醇在体内的分布和强度。B. 肝脏冰冻切片和油红 O 染色；C. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色。

（3） 病理诊断

采用肝脏组织切片和 HE 染色检测，以脂质/胆固醇在肝脏蓄积、或以大泡性为主的肝细胞脂肪变性为特征。

1. 动物症状观察

高胆固醇、高糖、高脂饮食的三组幼体体长均比 WT 组幼体体长增长。但高胆固醇、高脂饮食导致斑马鱼体重增加、肝区扩大，高脂组的幼体腹部和头部的透明度明显降低。高糖组体重未见变化，但头部和内脏区透明度也明显下降(图 1)。

图1. 高胆固醇、高糖或高脂饮食对斑马鱼幼体生长的影响

(A) 四组不同饲喂方案；(B) 四组饮食饲喂终点时的幼体表型；(C) 幼体在15 dpf 的平均体长 (n = 20).；和平均体重(n = 10，每组从100条中随机取10条幼体称重）。
a, 与对照组比较; b, 与EF组比较; c, 与HF组比较; *P < 0.05, #P < 0.01; Bar = 1 mm.

2. 病理改变

体内总胆固醇和总脂升高，显微镜下可见肝脏有明显脂质蓄积和脂肪泡，肝结构改变（图 2）。生化指标检测显示：过量饮食组的总脂质/甘油三酯、胆固醇和葡萄糖均明显高于对照组。胆固醇组的总脂质/胆固醇明显高于对照组，甘油三酯略高，葡萄糖低于对照组。高糖组的总脂质、甘油三酯和葡萄糖均高于对照组，而胆固醇水平与对照相当（图 2F-I）。

图 2. 脂质在斑马鱼幼体体内的蓄积

A. 油红染色示不同饮食组的幼体肝区脂质水平；B. 示四组幼体肝区胆固醇的蓄积水平；C. 示四组幼体躯干血管的胆固醇水平； D. 肝脏冰冻切片和油红 O 染色显示脂质在肝区的蓄积和脂肪变性；E. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色显示肝小叶排列变化和肝细胞内脂肪泡情况；F. 油红染色阳性区半定量统计比较；G. 胆固醇与每毫克蛋白之比；H. 甘油三酯与每毫克蛋 白之比；I. 糖与每毫克蛋白之比。F-I 数据来自斑马鱼肝脏。

*P < 0.05 vs. Control. Bar =100 μm。