小鼠血管平滑肌细胞原代培养

方法：

1) 10%水合氯醛2ml腹腔注射麻醉小鼠，浸泡在75%乙醇中。

2) 在无菌条件下打开胸、腹腔，暴露心脏，依次剪去胸腹腔器官直至暴露主动脉，完整分离主动脉，放入35mm无菌平皿中，加入1 ml无菌PBS( pH 7.2) ，迅速转移至超净台。

3) 用D-Hanks液反复冲洗，去除残留血液，用镊子小心剥离主动脉外的脂肪组织，小心剥去外膜，至血管光滑透明。

5)将主动脉放入DMEM液(含4.5g/L葡萄糖，10mmol/L丙酮酸，2mmol/L谷氨酰胺，100U/L的青霉素及链霉素，20%胎牛血清)中，用眼科剪纵行剪开主动脉，用刀片轻刮内膜2~3遍以去除内膜。

6)将剥离的血管转入另一个装有3ml含20% FBS DMEM/F12培养液的35mm无菌平皿中，用眼科剪剪碎，碎片大小1 mm×1 mm左右。

7) 将组织块均匀种植于培养瓶底，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上，加入2 ml 含20% FBS的新鲜DMEM/F12培养基；

8) 置于37℃、5%CO2细胞培养箱中静置4~5h使小块微干涸，待组织块牢固贴附于细胞瓶底，再轻轻翻转培养瓶，使组织块完全浸没于培养液中。

9) 放入含5%CO2的37 ℃培养箱，静止培养3 d，观察后换液。

10) 待细胞长满培养瓶底面积80%后，用0.25%的胰酶消化传代，传代2h后吸取上清液接种于另一培养瓶中，24 h后根据细胞贴壁情况收取未贴壁细胞悬液，离心5min，重悬后接种到新的培养瓶中，反复多次差速贴壁法纯化细胞，实验用第5~8代细胞。

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