慢性束缚致学习记忆障碍模型

文献中关于建立该模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束缚应激动物模型都采用常用的模式动物, 如大鼠和小鼠。多选用封闭群 Sprague- Dawley 、 Wistar大鼠 , 也有Lister和Fische大鼠;CD-1 、C3H 、BALAc、 LACA 小鼠。在不同生长阶段的研究中又包括幼鼠 、孕鼠 、成熟鼠和老龄鼠 。 本实验室一般选用8-10周龄左右的Wistar 大鼠、5-10周龄的SD大鼠和4-6周龄的ICR小鼠、10 ～ 12 周龄的C57BL /6J小鼠。雄性多见。

1、实验仪器

束缚采用的实验仪器为大、小鼠行为限制器。由聚酯材料构成，透明可视，方便监视大小鼠的行为状态。顶端和底部有多个直径1cm通气孔，有助于大小鼠的呼吸畅通、排泄物的排出，避免对建模带来干扰。行为限制器的长度可调，可将不同体重动物的束缚强度同一化。

图1 行为限制器实物图

2.实验方法

将行为限制器平放、底部敞开，使动物面朝行为限制器敞口进入内部。用配套的塞托封闭开口并固定塞托。使固定后，动物在行为限制器内的空间长度小于其身长，并保证只有头部可以自由活动而四肢活动受限（图2）。

图2 行为限制器的大鼠束缚

慢性束缚模型是采用行为制动的方式对动物产生单纯性心理应激，是比较常用的用于制备情绪、学习记忆障碍等动物模型的方法。引起抑郁、焦虑和学习记忆障碍的束缚强度不同文献报导有一定的差异。大多报导强度在4 h-8 h/day、连续14-48 d 。

慢性束缚致学习记忆模型的建立

一般慢性束缚致大鼠学习记忆障碍模型的建立采用每日限制大鼠活动 10 h( 18: 00 至次日 8: 00) ，限制活动期间各组禁食禁水。连续限制活动 28 d，第 29 天开始进行行为学测试。

一般慢性束缚致小鼠学习记忆障碍模型的建立采用每日限制大鼠活动 6h（10：00-16：00），限制活动期间各组禁食禁水。连续限制活动 21 d，第 22 天开始进行行为学测试。

3、行为学检测

慢性束缚到规定时间后，依实验需要，采用学习记忆行为实验方法进行检测。

4. 注意事项

（1）行为实验检测应在动物自由饮食饮水期间进行。

（2）实验动物大鼠体重应该控制在 280-300 g。小鼠体重应该控制在25-32 g

（3）由于束缚器是树脂材料的圆柱形，顶端有数个通气的小孔，才束缚早期由于动物挣扎剧烈，会出现动物窒息的情况，所以一开始需要我们 24 h 观察，及时排除动物窒息死亡的情形。

（4）行为测试完毕后的动物要返回行为限制器内至实验结束。

5. 模型分析指标

5.1 水迷宫实验

圆形迷宫直径为159 cm、高50 cm，池中水深25. 5 cm 左右，内置平台直径9 cm、高24 cm，水温维持在( 24 ± 1) ℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个试验周期内保持环境信息固定不变。将迷宫均分为4 个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径，空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余3 个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练3 次，每次变换入水点位置( 使动物可分别从3 个象限入水) ，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为60s 后，将动物放入水中，若动物在60 s 内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息10 s。若动物在60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为60 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留10 s。每只动物训练的时间间隔为40 min。每天每只动物3 次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过5d 的训练学习后，第6 天撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在60s 内在原平台象限的游程比、时间比，以及穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

5.2 水迷宫工作记忆

空间探索实验结束次日，开始工作记忆实验。工作记忆历时3d，分别将平台置于其余3 个不同象限中，每天变换平台位置，同一天内平台位置保持不变。每天训练3 次，依次从其余3 个非平台象限将动物面朝池壁放入水中。训练前不予适应，其余同空间训练阶段一致。计算3 天中，第2 次训练潜伏期的平均值，作为评价动物学习记忆能力的指标。

5.3新物体识别实验

实验箱为黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱，体积为60 cm × 40 cm × 80 cm，箱体左右两侧各有两排LED 灯条照明，既避免了强光直射对动物行为的干扰，又可以作为计算机对动物行为识别的背景光。顶部采用摄像头观察动物的活动情况及探索过程。实验过程分为3 个阶段: 适应期、熟悉期、测试期。适应期为3d，每天将动物依次放入实验箱内，熟悉环境10 min。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将两个完全相同的物体放入实验箱内对称的位置处，此两物体距离侧箱壁、箱后壁的距离均为10 cm。记录大鼠5 min 内对两物体的探索总时间。间隔30 min 后，进入测试期。测试期内，将其中一个熟悉物体换为另一个大小相近但形状和颜色不同的新颖物体，记录大鼠对新颖物体和熟悉物体的探索时间，用辨别指数( discriminationindex，DI) 来评价动物的学习记忆能力。辨别指数计算公式为DI = ( N-F) /( N + F) × 100%，其中N( new) 为新颖物体探索时间，F( familiar) 为熟悉物体探索时间。

慢性束缚28d 后的空间学习能力检测表明，Wistar 模型组学习记忆能力改变不明显，其潜伏期与对照组比较差异无显著性( 图1a) 。同时由图1可以看出，SD 模型组大鼠的潜伏期与对照组比，出现稳定性的增加，在空间学习最后一天( 第5 天) 束缚组的潜伏期与对照组比差异有显著性( P ＜0. 05) 。而两种品系大鼠水迷宫空间学习阶段的游泳速度与各自模型组比差异无显著性( 图1 b) 。

图1. 慢性束缚应激对两品系大鼠水迷宫空间记忆的影响

在工作记忆检测中，计算第2 次训练潜伏期的平均值作为评价工作记忆能力指标。由图2 a可知，每天束缚10 h，束缚28 d 后，SD 模型组寻台时间延长，潜伏期增加，与其相应对照组比差异有显著性( P ＜ 0. 05) 。而束缚应激对Wistar 大鼠工作记忆能力影响不显著。由图2b 可知，工作记忆阶段，束缚应激对Wistar、SD 两种大鼠游泳速度的影响不显著。

图2. 慢性束缚应激对两品系大鼠水迷宫工作记忆的影响

3. 新物体识别实验结果

如表1 所示，在新物体识别实验中，Wistar 大鼠模型组与对照组在熟悉期的探索总时间没有显著差异; 在检测期，模型组辨别指数( DI) 为负值且低于对照组，但没有显著差异。慢性束缚应激对SD 大鼠熟悉期的探索行为也没有产生显著影响，即模型组与对照组探索总时间没有显著差异; 而束缚应激使SD 模型大鼠检测期的DI 明显降低，且与对照组比差异性有显著( P ＜ 0. 05) 。