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实验动物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5或 icS5 floxed小鼠
试剂：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA
仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞工作站
实验操作规程：将Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系与Stat5或 icS5 floxed小鼠杂交，分别为对照组（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；实验1组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；实验2组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(扩增目的片段长174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR条件：预变性94℃3min；94℃变性30s，66℃复性1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。实验组小鼠按100mg/kg体重腹腔注射他莫昔芬，对照组小鼠注射等量的玉米油。通过 Tam 诱导， 然后分别在 12 小时和 1, 3, 5, 7, 30， 122和280天麻醉处死各组小鼠。分别取结肠、空肠、回肠组织，用冷PBS冲洗肠道组织，纵向剖开，放入多聚甲醛中固定过夜，制作冰冻切片在子代肠上皮细胞中追踪检测是否去除 Stat5 或活化 STAT5 能够改变肠上皮中的tdToamto 信号强度和位置.
1、 基因鉴定信息
图1 Lgr5, Rosa26tdTomato基因凝胶电泳鉴定结果
图2 潘氏细胞免疫组织化学染色结果
图3杯状细胞染色结果
在显微镜下观察诱导后不同时间点小肠干细胞的变化，发现诱导后3d隐窝底部已经开始出现荧光，并有向上移动的趋势； 诱导后5d荧光细胞已经移动到隐窝的快速增殖细胞(TA)部； 诱导后7d可看到有少量从隐窝分裂分化的细胞已经移动到绒毛顶端；诱导后14d有更多的荧光细胞到达小肠绒毛顶端，少量绒毛从隐窝基底到绒毛顶尖则全部带有荧光；诱导后45d可见整个小肠绒毛中荧光细胞更多、 更密实。 提示分化的细胞系来源于Lgr5 +干细胞， 小鼠小肠干细胞谱系追踪模型成功建立。
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2023-12-21 15:23:39
