气管镜感染MERSCoV绒猴模型

2、MERS-CoV感染绒猴病理学检查

MERS-CoV感染前和感染后1天和3天分别进行了肺部X光拍摄，感染前肺部并未观察到任何变化，感染1天时肺右下出现阴影，表明肺部有炎症反应。3天时阴影面积有所增大（图2A）。感染3天时，对剩余的1只攻毒狨猴进行了CT拍摄，发现了肺部出现片状低密度影，跟X光拍摄结果类似（图2B）。攻毒两天后，1只狨猴死亡，一只执行安乐死，大体解剖可见肺部有大面积充血呈暗红色。剩余1只狨猴于感染后3d执行安乐死，大体解剖亦可见肺部有不同程度充血呈暗红色，其位置跟X光和CT检查结果一致（图2C）。而对照组肺部无明显变化。显微病理检查可见攻毒组狨猴各个肺叶均发生多灶性到融合性渗出性肺炎，肺泡中可见大量渗出的炎性细胞（巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞为主）和纤维素，并发生肺水肿，局灶肺泡隔显著增宽，肺泡结构消失，血管扩张充血，周围可见大量炎性细胞浸润，出血（图3）。另外肾脏肾小球毛细血管扩张充血，少量肾小管上皮细胞不同程度变性坏死，有的管腔中可见蛋白管型形成（图3）。而对照组无此变化。其它组织未见明显的病理改变。免疫组化分析表明攻毒组狨猴肺和气管中可检测到病毒蛋白的表达，阳性细胞主要分布在Ⅰ型肺泡细胞和巨噬细胞。肺外器官并未检测到病毒蛋白的存在。对照组猴肺中并未检测到病毒特异蛋白的存在（图4）。

图2 狨猴胸透图（A）、CT（B）和肺大体解剖图(C)

图3 MERS-CoV攻毒后狨猴病理变化

(A-F：感染组狨猴肺组织弥漫性间质性肺炎，G-I：气管上皮细胞损伤，J-L：肾小管上皮细胞不同程度变性坏死，M-O：脾脏无病理损伤)

图4 MERS-CoV攻毒后绒猴免疫组化

（A-F：狨猴肺组织免疫组化，G-I：狨猴气管免疫组化。黑色箭头表示病原分布。）

3、qRT-PCR方法检测拭子和组织样品病毒载量

攻毒后分别对拭子样品和组织样品进行病毒核酸检测，结果发现攻毒组3只狨猴均可在肺部和气管检测到病毒核酸存在。攻毒两天后死亡的两只狨猴还在心脏、肝脏、脾脏和肾脏检测到病毒核酸的存在，表明存在病毒血症的可能性。而另一只狨猴并未在肺外组织检测到病毒核酸的存在。采集的拭子样品进行病毒核酸检测，结果显示在攻毒狨猴的肛拭子中均未检测到病毒核酸。死亡的2只狨猴均可在攻毒1天时的咽拭子中检测到病毒，但其中仅有一只在鼻拭子中检测到病毒核酸。攻毒组另外1只狨猴在鼻拭子和肛拭子并未检测到病毒核酸。对照组狨猴组织和拭子样品未检测到病毒核酸的存在（表1）。

表1 组织和拭子样品中病毒核酸检测

″-″ Virus was not detected in the samples.

ND,not done.

4、 拭子和组织样品中病毒滴度测定

对采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero细胞上进行病毒滴度测定，仅有1只狨猴在攻毒1天时的咽拭子中检测到病毒，滴度可达103TCID50/ml，该狨猴在攻毒两天后死亡。其它拭子样品并未分离到病毒。采集的组织样品进行病毒分离，只在肺部和气管分离到较高滴度的病毒。其他器官（肾脏、心脏、肝脏、脾脏）并未分离到病毒（图5）。对照组狨猴拭子和组织样品也未分离到病毒。

图5MERS-CoV 攻毒后狨猴各组织分毒情况

5、狨猴肺部电镜观察

对感染MERS-CoV病毒的肺组织进行透射电镜观察，结果发现在其胞浆中

可观察到病毒颗粒（图6），进一步证实病毒可在肺细胞中复制。

图6 感染MERS-CoV 的狨猴肺细胞的超微病理观察

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