骨发育异常老年样皮肤小鼠Gorab基因敲除模型

C57BL/6小鼠，1921年被培育出来，属于近交品系。最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖，且是第一个完成基因组测序的小鼠品系。主要用途有如下三个方面：

作为生理学与病理学的实验动物模型

构建转基因动物模型，保证遗传背景上的高度稳定性和实验数据的一致性。

作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系。

购买ES 细胞克隆XG183，该克隆中一个基因捕获载体（SA β -geo）被插入Gorab 基因第一个内含子中（图1）（购自BayGenomics 公司，USA）。按照说明书的相应标准和程序培养ES 细胞，并进行囊胚（C57BL/6）注射，然后通过胚胎移植将注射后的囊胚移植入代孕母鼠体内；将得到的嵌合体小鼠与亲本小鼠（C57BL/6）进行回交，得到F1 代小鼠。捕获载体的表达干扰了Gorab 基因的剪接，最终出现Gorab 第一外显子和β -geo 的融合表达。

图1：Gorab基因打靶策略和预测转录本

1. 基因型检测和蛋白表达检测

提取小鼠基因组DNA，用PCR 扩增插入的β -geo 基因，鉴定捕获载体是否插入小鼠基因组，同时检测插入位置的第一内含子片段，鉴定突变纯合子和突变杂合子（图2A）。取E18.5 天的胚胎进行PCR 检测，得到纯合子小鼠，且野生型小鼠、杂合子小鼠和纯合子小鼠的比例符合孟德尔遗传定律。取E18.5 天的小鼠胚胎，提取不同组织（表皮、真皮、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脑、骨骼肌）的总蛋白，使用Western blot 的方法检测Gorab 蛋白的表达，确认了纯合子的缺失突变（图2B）。

图2：A：PCR鉴定Gorab基因缺陷小鼠的基因型（M：DNA分子量标记；1-3: Gorab基因缺陷纯合子小鼠；4-6: Gorab基因缺陷杂合子小鼠；7-9: 野生型小鼠；P：阳性对照；N：阴性对照；B：空白对照）。B：Western blotting检测Gorab在不同组织内的表达（1-8泳道的组织样品分别为：表皮、真皮、心、肝、肺、肾、脑、骨骼肌）。

2. Gorab基因敲除小鼠的外观及皮肤和骨组织的组织学改变

繁殖存活的小鼠中未检测到Gorab-/-小鼠，提示Gorab-/-小鼠可能于胚胎发育期或围产期内已经死亡。Gorab+/-小鼠互交查阴栓推断胚胎日龄，取18.5天的胚胎进行PCR检测，得到Gorab-/-小鼠，且Gorab+/+小鼠、Gorab+/-小鼠和Gorab-/-小鼠的比例符合孟德尔遗传定律，推测Gorab-/-小鼠可能于围产期死亡。观察孕鼠生产，见小鼠出生后，Gorab-/-小鼠不能正常呼吸，且在出生后几分钟内死亡，Gorab-/-小鼠可能存在肌肉骨骼系统和呼吸系统的缺陷。

观察18.5天的小鼠胚胎，Gorab-/-小鼠的大小与Gorab+/+小鼠或Gorab+/-小鼠的大小相类似，没有显著差异。但Gorab-/-小鼠呈弓背姿势，正常脊柱弯曲消失，腹侧面皮肤紧绷导致躯体伸展受限，头圆，口鼻部突出等颅面部畸形，四肢短，腹部膨隆，皮肤褶皱较Gorab+/+小鼠或Gorab+/-小鼠少，表皮发亮（图3A）。这些表型改变提示其皮肤和骨骼的结构异常。

将18.5天的小鼠胚胎整体包埋，石蜡切片HE染色，观察皮肤和骨骼和肺的形态变化。Gorab-/-小鼠较Gorab+/+小鼠表皮基底细胞层平坦，未见上皮脚及毛囊原基，真皮层明显水肿，皮下肌层较薄（图3B）；软骨成熟区和钙化区变窄，骨组织过早钙化（图3C）；肺泡间隔增宽，肺泡腔狭窄（图3D）。

图3：A：胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠的外观。B：胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠腹部皮肤的组织学表现（HE染色），Bar=100μm。 C：胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠股骨的组织学表现（HE染色），Bar=200μm。D：胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠肺的组织学表现（HE染色），Bar=50μm。