SARSCoV恒河猴模型

　　实验用恒河猴在实验室内传代三次以上，遗传背景明确，年龄为1-3岁。按照国家微生物和寄生虫SPF等级通过检测，并证明抗SARS抗体阴性。病毒检测情况见表1。

表1 恒河猴病毒检测

恒河猴在生物安全三级（BSL-3）实验室内饲养，并按国家动物生物安全标准操作规程进行操作。

　　SARS-CoV病毒株为PUMC01（Sino-1, GenBank Acc. #：AY350750），分离自一个死于北京协和医院的典型的SARS患者（PUMCH）。该病毒株通过RT-PCR、序列分析和电子显微镜方法鉴定为SARS-CoV。通过鼻腔喷雾方法感染动物。

感染后，每天检测肛温、血液学指标和胸部放射线。每日观察咳嗽、鼻腔分泌物、呕吐、皮疹、呼吸衰竭、呼吸困难、腹泻和食欲降低等情况。克他命（Ketamine）安乐死后取样检测。

5.1 恒河猴感染后临床变化

　　恒河猴感染后出现体温升高，最高40.2℃，随后降至38℃左右。部分动物出现呼吸困难，摄食减少，胸腹部皮肤出现皮疹。未见咳嗽、流涕、呕吐、腹泻等临床表现。胸部放射线照射没有发现肺脏异常，白细胞计数无明显异常。对照组组动物均未出现体温升高、咳嗽、呕吐、皮疹、腹泻、窒息和呼吸困难。X线检测未发现肺部异常，WBC计数正常。

5.2 恒河猴感染后体内抗SARS-CoV抗体和SARS-CoV复制情况

　　感染病毒前，恒河猴中血清抗SARS-CoV特异性抗体阴性。测抗SARS-CoV特异性IgG抗体，第15－30天达高峰，最高达到1:320，同时也可检测到中和抗体的产生（表2）。对照组抗未检测到抗SARS-CoV IgG抗体。

表2 恒河猴感染SARS病毒后血清中和抗体滴度

* 1:10阴性

　　在感染后第5-60天，取咽拭子，并用巢式RT-PCR和病毒分离方法检测SARS-CoV 。感染后第5天咽拭子样本病毒载量检测结果为阳性。

　　病毒分离结果显示在感染后第5-15天的咽拭子和肺组织中可以分离到病毒（表3-4）。这些结果说明感染后第5天左右SARS-CoV开始复制。用感染后第5天的咽拭子样本接种细胞培养病毒，出现典型的细胞病理改变（CPE），对培养的悬浮物用电镜观察，可观察到SARS-CoV颗粒（图3-4）。对照组RT-PCR和病毒分离结果阴性。

表2恒河猴感染后SARS-CoV和抗SARS-CoV抗体检测

注：RT-PCR和病毒分离阳性是指从咽拭子，血液或任何组织的任一标本中得到即为阳性。

5.3组织脏器病理损伤检查

　　恒河猴感染后第5、7、10、15、20、30、60天进行病理检查，与对照组相比，感染动物可见明显的间质性肺炎改变，出血和水肿及肺泡腔内透明膜形成，肺泡网状纤维和弹力纤维破坏并增生，血管内皮细胞受损及再生，肺组织纤维化及肺气肿形成。Keratin、CD68、CD35、CD4、CD8免疫组化染色证实有相应的阳性细胞浸润，Gomorri’s银染色显示网状纤维和弹力纤维的破坏。不同时期的病理改变详细分述如下：

　　感染后第5天，大体观察双侧肺脏表面均可以看到暗红色片状的病变区 (图1)。镜下观察出血性间质性肺炎均匀分布在每个肺叶，肺泡间隔增厚，单核细胞浸润。大多数肺泡的内皮细胞脱落。肺泡腔和扩张的呼吸道内填充着细胞聚集物，大多数为巨噬细胞 (图2 A-B)。 噬红细胞现象和含铁血黄素很常见 (图2 C-E)。在一些被破坏的肺泡中，可以看到早期的透明膜 (图2 F)。在呼吸道及肺泡内可见CD68阳性细胞，肝脏可见肝细胞脂肪变性及局灶性坏死(图2 G-H)。

图1恒河猴感染后肺组织大体观察。A正常对照肺组织。B恒河猴感染SARS-CoV7天后肺组织

图2 恒河猴感染5天后组织病理检查。A. 肺间质有单核细胞浸润(HE, 40×)； B.肺泡腔单核细胞和脱落上皮细胞堆积(HE,100×)；C.肺间质出血(HE,100×)；D 和E.肺门淋巴结铁离子阳性巨噬细胞吞噬红细胞(HE,200×)；F.肺泡透明膜形成（HE, 100×)； G. CD68 阳性单核细胞浸润(免疫染色,100×)；H.肝小叶上呈现局灶性坏死伴有单核细胞侵润(HE, 100×)。

　　感染后第7天，出现明显的出血性间质性肺炎，肺泡结构破坏，肺泡腔内充满巨噬细胞、脱落的上皮细胞、细胞碎屑及泡沫样细胞(图3 A)。小静脉内皮细胞水肿(图3 B)。噬红细胞现象仍很明显(图3C)。

图3恒河猴感染7天后组织病理检查。A.明显的间质性肺炎，肺泡囊扩张，巨噬细胞、泡沫细胞和淋巴细胞肿大(HE,200×)；B.小静脉周围水肿，伴随巨噬细胞淋巴细胞浸润(HE,100×)；C.肺泡间隔严重出血性改变(HE,200×)。

　　感染后第10天，可见支气管上皮细胞明显增生，肺泡上皮细胞分泌大量的粘液。呼吸性支气管和终末细支气管腔内充满粘液、炎细胞和细胞碎片(图4 A)。在肺大部分区域有明显的水肿。Gomorri’s嗜银染色可以看到肺泡间隔被破坏，胶原纤维增生(图4 B)。

图4 恒河猴感染10天后组织病理检查。A. 肺泡水肿和单核细胞浸润(MCT 染色,100×)；B 间隔网状纤维和弹性纤维破坏(Gomorri’s银染,200×)。

　　感染后第15天，大多数肺叶中均可见到明显的间质性肺炎改变。在扩张的肺泡间隔内有出血点，肺泡内充满吞噬了红细胞的巨噬细胞和泡沫样细胞（图5A）。通过Gomorri’s嗜银染色可以观察到肺泡网状纤维和弹力纤维被破坏（图5B）。肺泡间隔的免疫组织化学染色可见角蛋白阳性及CD68阳性细胞出现（图5C）。

图5 恒河猴感染15天后组织病理检查。A.肺泡间隔的吞噬细胞和泡沫细胞(HE,200×)； B 间隔网状纤维破坏( Gomorii’s 银染, 100×)；C.肺泡间隔出现CD68阳性巨噬细胞(免疫组织化学染色,200×).

　　感染后第20天，肺泡间隔仍可以见到严重的间质性肺炎表现，浸润的细胞大多数为巨噬细胞和单核细胞(图6 A)。胸膜增厚，纤维组织增生，单核细胞浸润(图6 B)。脾脏红髓充血。充血的肾小球上皮细胞和内皮增生。在肝脏内可以观察到局灶性坏死(图6 C)。

图6 恒河猴感染20天后组织病理检查。A.明显的间质性肺炎，肺泡中堆积单核细胞和泡沫细胞(HE,200×)； B.渗出性胸膜炎，纤维素和纤维细胞渗出(HE, 100×)；C.肝脏中度脂肪性变及局灶性坏死 (HE,100×)。

　　感染后第30天，仍然可见间质性肺炎，有散在的单核细胞浸润，纤维组织开始增生，肺泡腔内有透明膜形成（图7 A）。有慢性胸膜炎和肺气肿（图7 B）。淋巴结增生，生发中心扩大，淋巴母细胞和大淋巴细胞数量增加（图7C）。

图7 恒河猴感染30天后组织病理检查。A.肺泡透明膜形成(箭头所指), (HE,200×)；B.胸膜水肿和肺泡腔扩张炎细胞浸润(HE,200×)；C.肝脏内局灶性坏死(HE, 100×)。

　　感染后第60天，肺组织内有局灶性的轻微的间质性肺炎改变(图8 A)，角蛋白染色显示大多数肺泡上皮完整，并有少量CD68染色阳性的巨噬细胞。可见到肺泡腔扩张，肺气肿形成。肺泡间隔的纤维被破坏，一些肺泡之间相通(图8 B)。

图8 恒河猴感染60天后组织病理检查。A. 肺组织内有局灶性的轻微的间质性肺炎改变(HE, 200×)；B. 肺泡间隔纤维破坏，局部肺气肿(HE, 100×)。

　　对照组动物各脏器未见病理改变。