卵巢摘除模型

雌性ICR小鼠或者C57Bl/6雌鼠，8-12周龄，造成参考记忆障碍造模时长需4周以上。常规饲养。

1.卵巢摘除术

结合Merle E及常艳报道的小鼠卵巢摘除术的方法，操作步骤如下：小鼠称重，4%水合氯醛溶液(400mg/kg bw)腹腔注射麻醉；将小鼠呈俯卧式固定于手术板上，以其两侧后肢大腿根部上缘连线与背部正中线交点以上0.5cm左右为中心，沿背部后中线作一长约0.5-1cm的皮肤切口；沿皮下组织向左侧游离大约0.5cm，可见菲薄的肌层下方发亮的脂肪组织；用镊子提起脂肪团表面肌层，纵行剪开肌层，在脂肪组织中找到左侧卵巢；结扎子宫角末端，摘除左侧卵巢、输卵管和一小部分子宫角，缝合剪开的肌层；同法向右游离切除右侧卵巢；最后缝合背部皮肤；假手术组除不摘除卵巢外其余操作和模型组相同；术后24h以后对小鼠行至少连续5天的阴道涂片检查，判断卵巢摘除是否完全。

图1卵巢摘除过程

2.阴道涂片检查

为评价卵巢摘除是否彻底，术后连续5天每天固定时间行阴道涂片检查，方法如下：用小鼠灌胃针吸取大约两滴生理盐水，在小鼠阴道内吸打3-4次；吸出适量阴道液置于96孔板中，于普通光学显微镜下观察；阴道细胞检查结果角化细胞均不超过50%判定为卵巢摘除彻底。

3.模型分析指标

（1）物体认知-新物体识别实验过程分为3个阶段：适应期、熟悉期、测试期。适应期为3天，每天将动物背对箱体依次放入实验箱中部位置后开始使之适应实验箱环境10 min。适应期结束后，次日进行熟悉期和测试期。熟悉期，将两个完全相同的物体放入实验箱内相邻的磁铁处固定，记录小鼠5 min内对两物体的探索行为，比较动物对熟悉物体A1和熟悉物体A2的探索时间来评价动物对物体所在位置是否存在偏爱性，用动物对物体对的总探索时间来评价动物对物体的探索能力是否存在偏差。间隔30 min后开始测试期，将其中一个熟悉物体变换为新物体，另一熟悉物体保持不变。记录小鼠在测试期内对新颖物体和原熟悉物体的探索时间，用相对辨别指数来评价动物的学习记忆能力。相对辨别指数计算公式为DI = (N-F) /(N+F) ×100%，其中N（new）为动物对新颖物体的探索时间，F（familiar）为动物对原熟悉物体的探索时间。

在实验过程中，为避免动物对某一位置产生偏爱，物体的位置要相互平衡，以便减少实验误差。新物体识别实验反映的是动物对物体辨别的短时、非空间记忆能力。

（2）避暗实验 避暗实验是利用啮齿类动物趋暗避明的习性设计，当动物进入暗室即遭足底电击，反复数次后形成条件反射。该实验用于检测啮齿类动物的短时学习记忆和再现能力。实验分为避暗学习Day1和避暗巩固Day2两个阶段，历时2d。

避暗学习阶段Day1：首先将避暗实时在线软件系统设置为：刺激电流1.5mA，刺激电压30V，实验时间5min。接着在开始实验前将动物背朝通道小门放入明室自由活动5min适应测试箱体环境后取出。随后开始避暗学习实验，在摄像头识别到动物第一次进入暗室后，暗室栅栏开始通电，动物遭受电击会逃到明室，持续5分钟，实验结束。避暗学习结束后立即将动物放回睡眠干扰仪内继续睡眠干扰。

避暗巩固阶段Day2：避暗学习后24h进行。参数设置同前。将动物背朝通道小门放入明室立即开始实验，暗室即可通电，记录5min内错误次数(进入暗室的次数)，潜伏期(第一次从明室到暗室的时间)、暗室时间、明室时间、暗室路程等指标评价动物的避暗记忆再现能力。

（3）水迷宫实验

3.1水迷宫空间记忆

迷宫分为 4 个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径， 空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余 3 个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练 3 次，每次变换入水点位置( 使动物可分别从 3 个象限入水)，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应 10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为 60s 后，将动物放入水中，若动物在 60 s 内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息 10 s。若动物在 60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为 60 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留 10 s。每只动物训练的时间间隔为 40 min。每天每只动物 3 次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过 5d 的训练学习后，第 6 天撤去平台， 进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在 60s 内在原平台象限的游程比、时间比，以及穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

3.2水迷宫工作记忆

空间探索实验结束次日， 开始工作记忆实验。工作记忆历时 3d，分别将平台置于其余 3 个不同象限中，每天变换平台位置，同一天内平台位置保持不变。每天训练 3 次，依次从其余 3 个非平台象限将动物面朝池壁放入水中。训练前不予适应， 其余同空间训练阶段一致。计算 3 天中， 第 2 次训练潜伏期的平均值，作为评价动物学习记忆能力的指标。

OVX小鼠8W时在新物体识别实验中其相对辨别指数显著降低，即8W的模型动物其对新旧物体的辨别能力降低

图2不同造模时长的卵巢摘除模型物体认知（新物体）能力情况

与假手术组（Sham组）相比，OVX小鼠4W时在避暗实验中其入暗潜伏期显著降低，错误次数、暗室时间和明室近口区时间显著增加

图3不同造模时长的卵巢摘除模型在避暗实验中的表现-暗室时间

图4不同造模时长的卵巢摘除模型在避暗实验中的表现-错误次数

OVX小鼠8W时在水迷宫中工作记忆实验的潜伏期显著增加，8W时模型动物的空间工作记忆能力出现损伤。

图5不同造模时长的卵巢摘除模型在水迷宫实验中的表现-工作记忆潜伏期