动物模型

小鼠模型

全身性表达IL4V2转基因小鼠神经特异Calmh1转基因小鼠（PDGFhCalmh1）高表达P2X7受体的ICN1诱导的小鼠淋巴细胞白血病模型 YIDFH小鼠 BACE1敲除小鼠系统表达DKK3基因小鼠 Pax1点突变小鼠外耳畸形模型脑组织特异Cre转基因小鼠 LEMAF小鼠 KIAA0174基因敲低小鼠
鹌鹑模型

高脂高嘌呤饮食联合氧嗪酸钾诱导鹌鹑糖脂代谢紊乱模型建立鹌鹑动脉粥样硬化模型鹌鹑高尿酸血脂代谢症动物模型建立高尿酸血症鹌鹑肠道菌群结构分析高蛋白高钙饮食合并限制饮水建立鹌鹑痛风模型
大鼠模型

PON1基因敲除大鼠 H7N9滴鼻途径感染Lewis大鼠模型 Brainbow大鼠(Wistar背景）SPINK8cre工具大鼠 DNMT3A转基因大鼠脊髓组织特异性表达cre工具大鼠 Epha4敲除大鼠 CYP3AA9基因敲除大鼠 mcherry荧光标记大鼠（LongEvans背景）链脲霉素诱导的糖尿病肾病大鼠模型
疾病模型

人大细胞肺癌H460红色荧光标记肿瘤模型 H5N1禽流感病毒布氏田鼠模型 A/Brisbane/10/07(H3N2)滴鼻感染雪貂模型慢性束缚致抑郁模型 DOCA诱导急性盐敏感性高血压模型 A/California/07/2009(H1N1)滴鼻途径感染豚鼠模型人食管癌细胞EC9706红色荧光标记肿瘤模型人结肠腺癌细胞HCT8绿色荧光标记肿瘤模型 A/Anhui/1/2013(H7N9)滴鼻途径感染布氏田鼠模型睡眠干扰模型
犬鼠模型

犬动物模型：锥形非血管化膀胱移植输尿管重建静脉注射大肠杆菌制备高动力型感染性休克犬模型犬扩张型心肌病变模型建立犬自体同源颅骨成形术模型的建立 ApoE基因突变犬动脉粥样硬化及临床并发症模型 A/California/07/2009（H1N1）滴鼻感染比格犬模型富血小板血浆协同改善Beagle犬手术诱导的骨关节炎模型建立右心室起搏致心力衰竭犬模型
羊类模型

陕北细毛羊动物模型构建鄂尔多斯细毛羊动物模型构建蒙古羊动物模型构建兰州大尾羊模型构建鲁中山地绵羊动物模型构建湖羊模型建立西藏羊动物模型构建小尾寒羊动物模型构建
猪类模型

甲型H1N1流感病毒气管插管感染猪模型 A/California/07/2009(H1N1)经气管途径感染猪模型免疫抑制剂诱导小耳畸形猪模型 A/Vietnam/1194/2004（H5N1）经气管途径感染猪模型 H5N1气管镜感染猪模型双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁的猪动物模型
鱼类模型

心肌损伤斑马鱼模型帕金森疾病（PD）斑马鱼模型急性白血病斑马鱼模型丙型肝炎病毒亚复制子斑马鱼模型 ddx18基因敲除导致的斑马鱼白血病模型耳功能损伤斑马鱼模型非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）斑马鱼模型
猴类模型

SHIVSF162P3阴道途径感染恒河猴模型 H5N1禽流感病毒食蟹猴模型 SHIVSF162P3静脉途径感染恒河猴模型 A/SZ/406H/2006(H5N1)经气管途径感染恒河猴模型 SHIVKB9静脉途径感染恒河猴模型 H5N1禽流感病毒恒河猴模型 SHIVchn19p4静脉途径感染恒河猴模型 SIVmac251阴道途径感染恒河猴模型 SHIV1157ipd3N4直肠途径感染恒河猴模型 SHIVSF162P3直肠途径感染恒河猴模型
兔类模型

心肌铁过载兔模型的制作新西兰兔骨缺损动物模型 SARSCoV滴鼻途径感染新西兰兔模型心搏骤停兔模型构建过敏性紫癜兔模型实验性牙槽突裂兔模型兔模型：术后镇痛效果临床评价鼠疫菌的豚鼠和新西兰兔模型建立

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Epha4敲除大鼠

2023-12-21 15:33:11

原创版权

摘要：心律失常（arrhythmia）是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，即心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病，亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势、是否导致严重血流动力障碍有关，可突然发作而致猝死，亦可持续累及心脏而致其衰竭。

遗传性心律失常多为基因通道突变所致，如长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征等。后天获得性心律失常可见于各种器
注：因业务调整，暂不接受个人委托测试。

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CSTR:16397.09.0I01001030

资源中文名称

Epha4敲除大鼠

资源英文名称

SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS

疾病概述

心律失常（arrhythmia）是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，即心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病，亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势、是否导致严重血流动力障碍有关，可突然发作而致猝死，亦可持续累及心脏而致其衰竭。遗传性心律失常多为基因通道突变所致，如长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征等。后天获得性心律失常可见于各种器质性心脏病，其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病、心肌炎和风湿性心脏病多见，尤其在发生心力衰竭或急性心肌梗死时。另有发生在基本健康者或植物神经功能失调患者中的心律失常。其他病因包括电解质或内分泌失调，麻醉，低温，胸腔或心脏手术，药物作用和中枢神经系统疾病等，部分病因不明。

实验动物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建//蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

仪器及耗材	生产厂商
NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪	日本滨松光子学株式会社
Vevo770小动物超声影像系统	VisualSonics
激光共聚焦扫描显微镜	Leica
透射电子显微镜	JEOL
显微注射仪	Nikon
光学显微镜	Nikon
化学发光凝胶成像系统	BIO-RAD
PCR仪	BIO-RAD
组织脱水机	Leica
石蜡切片机	Leica
石蜡包埋机	Leica
冰冻切片机	Leica
电泳仪	BIO-RAD
电泳槽	Tanon
数码凝胶图像处理系统	Tanon
组织匀浆机	POLYTRON
恒温培养箱温控振荡箱	Incucell TAITEC
离心机	Eppendorf
摇床	SCILOGEX
塑料薄膜封口机	德清拜杰有限公司
电动鼓风干燥箱	天津市泰斯特仪器有限公司
电子称量器（量程0.5g-620g）	奥豪斯仪器（常州）有限公司
电子称量器（量程0.1mg-220g）	Sartorius
4℃冰箱	海尔集团
-80℃冰箱	SANYO
-20℃冰箱	SANYO
涡旋振荡器	上海沪西分析仪器厂
移液器	Eppendorf

3.1.3实验试剂

试剂	生产厂商
体外转录用试剂盒	Ambion
Taq DNA聚合酶	TaKaRa
T7 转录试剂盒	Invitrogen
T4 DNA裂连接	TaKaRa
胶回收试剂盒	Qiagen
质粒提取试剂盒	Axygen
Trizol试剂	Invitrogen
逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒	Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司
Epha4（ab157588）抗体	Abcam
GADPH	Santa Cruz Biotechnology
NC膜	Millipore
化学发光液	ImmunoCruz
蛋白质分子量标记物	Takara
蛋白酶抑制剂	罗氏
组织裂解液	Thermo
丽春红	Beyotime
BCA试剂盒	Beyotime
Westernblot洗液（10×）	Beyotime
30%Acr-Bis	Beyotime
SDS-PAGE电泳液	Beyotime
Western blot转膜液（粉剂）	Beyotime
TEMED	Beyotime
过硫酸铵	Beyotime
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液	Beyotime
1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液	Beyotime
琼脂	BD公司
异丙醇	北京化工厂
脱脂奶粉	内蒙古伊利实业集团股份有限公司

3.1.4模型构建流程

在Epha4基因的启动子后插入一个报告基因mCherry，造成移码突变，实现基因敲除，制备Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。

3.1.5Epha4敲除大鼠的建立

3.1.5.1Epha4敲除大鼠模型的建立

设计方案

图 1. Epha4敲除模型构建设计方案

构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG

R-EPHA4-gRNA UP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC

R-EPHA4-gRNA DOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG

靶点2:

CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG

R-EPHA4-gRNA UP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC

R-EPHA4-gRNA DOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
显微注射

超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

基因型鉴定

剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
根据测序结果确定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立

根据3.1.5.1获得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Epha4-/-与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Epha4+/-大鼠。之后使8周龄左右Epha4+/-大鼠进行第二轮杂交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
重复步骤（5）一次。
加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
重复步骤（7）一次。
10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。
将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

模型表型数据

4.1Epha4敲除大鼠模型的建立

通过PCR方法进行基因型鉴定Epha4敲除大鼠基因型。免疫印迹Western blot方法鉴定Epha4-/-大鼠epha4蛋白的敲除（图2）。

图2 Epha4敲除大鼠模型基因型鉴定及基因蛋白表达水平鉴定

4.2Epha4敲除大鼠生存率分析

对Epha4-/-基因型和WT野生型进行生存率分析显示，WT生存正常，生存率为100%，Epha4-/-生存率下降（图3）。

图3Epha4敲除大鼠生存率分析

4.3 Epha4敲除大鼠心脏重量/体重比分析

对WT和Epha4-/-进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。实验结果，与野生型相比，2、6、9月龄Epha4-/-大鼠心脏/体重比均无明显变化（图4）。2MWT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.38± 0.035（%），KO大鼠0.393± 0.052（%）；6MWT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.352± 0.024（%），KO大鼠0.0.369± 0.035（%）；9MWT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.311± 0.043（%），KO大鼠0.338± 0.047（%）。从形态观察发现，Epha-/-大鼠的心房与野生大鼠相比明显增大，计算心房重量与心脏重量比值（atriumweight/body weight, AW/HW）。实验结果显示，与WT相比，Epha4-/-右心房/心脏重量比显著增加，2MWT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为5.939± 1.192（%），KO大鼠为7.112± 1.283（%）；6M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.655± 0.541（%），KO大鼠为6.892± 0.857（%），有显著性差异（图5，*P<0.05）；9M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.72± 0.936（%），KO大鼠为7.478± 0.681（%），差异非常显著（图5，**P<0.01）。

图 4 Epha4敲除大鼠HW/BW比率分析

图 5 Epha4敲除大鼠AW/HW比率分析

4.4 M型超声心动图检测Epha4敲除大鼠心脏的结构和功能

为分析心脏结构与功能状态改变，本研究通过M型超声心动图检测1、2、6、9四个月龄野生和敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比，自2M起，Epha4-/-大鼠射血分数明显下降，差异显著（图6，*P<0.05，**P<0.01），而左心室内径、室壁均无明显变化（图6）。

图 6Epha4敲除大鼠左心室结构功能分析

注：射血分数（ejection fraction，EF）；舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；、。*P<0.05，**P<0.01，versus同窝WT大鼠。

4.5磁共振成像分析Epha4敲除大鼠心房结构和功能

为进一步分析Epha4敲除大鼠心房的结构和功能，本研究通过核磁分析2、6、9月龄WT和Epha4敲除大鼠左右心房容积和射血分数。结果表明，与WT大鼠相比，Epha4敲除大鼠左右心房容积均无明显变化。但6、9月龄敲除大鼠心房射血分数与野生大鼠相比明显下降，6M组WT左房射血分数为69.763±9.918（%），KO左房射血分数为47.35±7.458（%）；WT右房射血分数为69.123±14.592（%），KO右房射血分数为39.67±7.653（%）。9M组WT左房射血分数为52.738±10.739（%），KO左房射血分数为46.637±4.487（%）；WT右房射血分数为56.978±14.281（%），KO右房射血分数为32.967±2.492（%）（图7）。

图 7Epha4敲除大鼠左右心房结构功能分析

4.6心电分析Epha4敲除大鼠心传导功能

从上面的结果我们已知，心房的改变发生在心室改变之前，为了进一步分析心房的电传导功能，我们对WT和Epha4敲除大鼠进行了心电图记录。结果显示，自1M起，敲除大鼠的心电出现了明显的改变，p波消失（图8），QRS波峰值增高，QT间期延长（图9，**P<0.01）。

图 8Epha4敲除大鼠心电图记录

图 9 Epha4敲除大鼠心电指标分析

我们的承诺

　　北检检测技术研究院承诺：我们将根据不同产品类型的特点，并结合不同行业和国家的法规标准，选择适当的检测项目和方法进行分析测试，或根据您的要求进行试验分析。为了不断改进我们的工作，我们致力于提高产品质控分析、使用性能检测能力，并持续加强我们团队的科研技术。同时，我们将积极跟进新的技术和标准，以最大程度地满足您的需求和市场要求。

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