动物模型

小鼠模型

H9N2接触传播小鼠模型全身性表达IL10转基因小鼠心脏组织特异性过表达cTnTR92Q转基因肥厚型心肌病小鼠模型小鼠肺癌LEWIS红色荧光标记细胞C57/BL小鼠肿瘤模型 A/J小鼠 MEEAG小鼠免疫系统人源化结直肠癌异种移植小鼠模型全身性表达IL32转基因小鼠 NOD/ShiLtJ小鼠小鼠乳腺癌细胞66c14荧光素酶标记肿瘤模型
鹌鹑模型

鹌鹑高尿酸血脂代谢症动物模型建立高尿酸血症鹌鹑肠道菌群结构分析高脂高嘌呤饮食联合氧嗪酸钾诱导鹌鹑糖脂代谢紊乱模型建立鹌鹑动脉粥样硬化模型高蛋白高钙饮食合并限制饮水建立鹌鹑痛风模型
大鼠模型

H7N9滴鼻途径感染Lewis大鼠模型 Ephb4条件性敲除大鼠颈脊髓挫伤大鼠模型诱导型海马组织特异性cre工具大鼠过敏性紫癜大鼠模型 Olig2Cre工具大鼠 Defb23基因敲除大鼠 PUBCCre工具大鼠（Wistar)Nkx21Cre工具大鼠 Iscalcre工具大鼠
疾病模型

人食管癌细胞KYSE510绿色荧光标记肿瘤模型人结直肠癌细胞HCT116荧光素酶标记肿瘤模型 A/Vietnam/1194/2004（H5N1）滴鼻途径感染布氏田鼠模型 A/California/07/2009(H1N1)滴鼻途径感染布氏田鼠模型 H5N1禽流感病毒布氏田鼠模型绿色荧光标记人胰腺癌细胞SW1990皮下接种裸鼠肿瘤模型长期高尿酸血症慢性肾损伤模型泊洛沙姆407（P407）诱导的金黄地鼠脂代谢紊乱模型布氏田鼠 2009年甲型H1N1流感布氏田鼠模型
犬鼠模型

ApoE基因突变犬动脉粥样硬化及临床并发症模型犬扩张型心肌病变模型建立静脉注射大肠杆菌制备高动力型感染性休克犬模型犬自体同源颅骨成形术模型的建立 A/California/07/2009（H1N1）滴鼻感染比格犬模型犬动物模型：锥形非血管化膀胱移植输尿管重建富血小板血浆协同改善Beagle犬手术诱导的骨关节炎模型建立右心室起搏致心力衰竭犬模型
羊类模型

湖羊模型建立鲁中山地绵羊动物模型构建蒙古羊动物模型构建陕北细毛羊动物模型构建兰州大尾羊模型构建小尾寒羊动物模型构建西藏羊动物模型构建鄂尔多斯细毛羊动物模型构建
猪类模型

免疫抑制剂诱导小耳畸形猪模型 A/California/07/2009(H1N1)经气管途径感染猪模型 H5N1气管镜感染猪模型甲型H1N1流感病毒气管插管感染猪模型 A/Vietnam/1194/2004（H5N1）经气管途径感染猪模型双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁的猪动物模型
鱼类模型

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）斑马鱼模型 ddx18基因敲除导致的斑马鱼白血病模型帕金森疾病（PD）斑马鱼模型耳功能损伤斑马鱼模型丙型肝炎病毒亚复制子斑马鱼模型急性白血病斑马鱼模型心肌损伤斑马鱼模型
猴类模型

帕金森疾病恒河猴基因修饰模型 SIVmac251阴道途径感染恒河猴模型 SIVmac239静脉途径感染恒河猴模型结核猴模型（含耐药结核猴模型）气管镜感染MERSCoV绒猴模型 H5N1禽流感病毒恒河猴模型 SHIVKU1静脉途径感染恒河猴模型 SHIVchn19p4静脉途径感染恒河猴模型 H5N1禽流感病毒食蟹猴模型基于HIV融合抑制剂的艾滋病潜伏感染恒河猴模型
兔类模型

心搏骤停兔模型构建实验性牙槽突裂兔模型 SARSCoV滴鼻途径感染新西兰兔模型心肌铁过载兔模型的制作鼠疫菌的豚鼠和新西兰兔模型建立新西兰兔骨缺损动物模型兔模型：术后镇痛效果临床评价过敏性紫癜兔模型

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DNMT1心肌特异性基因敲除SD大鼠

2023-12-21 15:32:38

原创版权

摘要：心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。

几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基
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CSTR:16397.09.0I01001002

资源中文名称

DNMT1心肌特异性基因敲除SD大鼠

资源英文名称

DNMT1 cardiac specific knockout SD rat

疾病概述

心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基础上，一些因素亦可诱发心衰的发生，常见诱因包括，感染，严重心律失常，心脏负荷增大，药物中毒（如洋地黄）等等。心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现，包括呼吸困难，运动耐力下降，心室腔增大，心脏功能下降（LVEF<40-50%），心脏顺应性降低，心室腔内淤血，肺循环及体循环淤血。临床检查手段，包括超声影像分析，心电图，心衰标志物（B型利钠肽（BNP），N末端B型利钠肽原（NT-proBNP））心肌坏死标志物（心肌肌钙蛋白T（cTnT）及心肌肌钙蛋白I（cTnI））。临床治疗方法，包括强心（米力农，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重构（卡维地洛）及心脏移植。

实验动物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

仪器及耗材	生产厂商
NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪	日本滨松光子学株式会社
Vevo770小动物超声影像系统	VisualSonics
激光共聚焦扫描显微镜	Leica
透射电子显微镜	JEOL
显微注射仪	Nikon
光学显微镜	Nikon
化学发光凝胶成像系统	BIO-RAD
PCR仪	BIO-RAD
组织脱水机	Leica
石蜡切片机	Leica
石蜡包埋机	Leica
冰冻切片机	Leica
电泳仪	BIO-RAD
电泳槽	Tanon
数码凝胶图像处理系统	Tanon
组织匀浆机	POLYTRON
恒温培养箱温控振荡箱	Incucell TAITEC
离心机	Eppendorf
摇床	SCILOGEX
塑料薄膜封口机	德清拜杰有限公司
电动鼓风干燥箱	天津市泰斯特仪器有限公司
电子称量器（量程0.5g-620g）	奥豪斯仪器（常州）有限公司
电子称量器（量程0.1mg-220g）	Sartorius
4℃冰箱	海尔集团
-80℃冰箱	SANYO
-20℃冰箱	SANYO
涡旋振荡器	上海沪西分析仪器厂
移液器	Eppendorf

3.1.3实验试剂

试剂	生产厂商
体外转录用试剂盒	Ambion
Taq DNA聚合酶	TaKaRa
T7 转录试剂盒	Invitrogen
T4 DNA裂连接	TaKaRa
胶回收试剂盒	Qiagen
质粒提取试剂盒	Axygen
Trizol试剂	Invitrogen
逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒	Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司
DNMT1（MA5-16169）抗体	Invitrogen
GADPH	Santa Cruz Biotechnology
NC膜	Millipore
化学发光液	ImmunoCruz
蛋白质分子量标记物	Takara
蛋白酶抑制剂	罗氏
组织裂解液	Thermo
丽春红	Beyotime
BCA试剂盒	Beyotime
Westernblot洗液（10×）	Beyotime
30%Acr-Bis	Beyotime
SDS-PAGE电泳液	Beyotime
Western blot转膜液（粉剂）	Beyotime
TEMED	Beyotime
过硫酸铵	Beyotime
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液	Beyotime
1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液	Beyotime
琼脂	BD公司
异丙醇	北京化工厂
脱脂奶粉	内蒙古伊利实业集团股份有限公司

3.1.4模型构建流程

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第1外显子两端插入两个loxP位点来构建DNMT1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。

3.1.5DNMT1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立

3.1.5.1DNMT1条件性敲除大鼠模型的建立

（1）设计方案

图 1. DNMT1条件性敲除模型构建设计方案

（2）构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG

R-DNMT1-gRNA UP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-DNMT1-gRNA DOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶点2:

AGCCCTGAACTCCTTATG TGG

R-DNMT1-gRNA UP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-DNMT1-gRNA DOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

（3）合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

（4）构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

（5）显微注射

1）超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。

2）受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3）雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。

4）受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5）胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

（6）基因型鉴定

1）剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

3）PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

（7）结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

（8）根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. DNMT1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠（DNMT1flox/flox/MHC-Cre）的建立

根据3.1.5.1获得DNMT1flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右DNMT1flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的DNMT1flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右DNMT1flox/+大鼠与DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。

图2. DNMT1 flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

（1）加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。

（2）12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。

（3）加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。

（4）将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。

（5）加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。

（6）重复步骤（5）一次。

（7）加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。

（8）重复步骤（7）一次。

（9）10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。

（10）将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

我们的承诺

　　北检检测技术研究院承诺：我们将根据不同产品类型的特点，并结合不同行业和国家的法规标准，选择适当的检测项目和方法进行分析测试，或根据您的要求进行试验分析。为了不断改进我们的工作，我们致力于提高产品质控分析、使用性能检测能力，并持续加强我们团队的科研技术。同时，我们将积极跟进新的技术和标准，以最大程度地满足您的需求和市场要求。