心肌组织特异性过表达cTnTR141W转基因小鼠

C57BL/6J

扩增并经测序比对正确的cTnTR141W突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达cTnTR141W表达载体（图1A）。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型（图1B），Northern Blot法分析cTnTR141W的表达情况（图2）。

图1. cTnTR141W转基因小鼠模型的建立及鉴定

注：(A)将cTnTR141W突变基因片段插入α-MHC心脏组织特异性启动子下游构建转基因表达载体. (B) PCR法鉴定小鼠基因型. 1: 阳性对照；2: 分子量标记；20:阴性对照；21:空白对照；3,15,18: cTnTR141W阳性转基因小鼠；其余为阴性转基因小鼠.

图2. Northern Blot法分析cTnTR141W转基因小鼠心肌组织cTnT的表达

（A）Northern Blot法观察内源及转基因外源cTnT基因RNA的表达情况. (B) PCR法分析未经及经酶消化后cTnT的表达，1,2:野生小鼠基因组对照；3,4:首建鼠1号；5,6:首建鼠13号；7,8:首建鼠16号.

1.从2月龄开始cTnTR141W转基因小鼠即出现死亡，至8月龄时cTnTR141W转基因小鼠死亡率为11.1%（图3，n= 19），尸检可见心腔扩张和附壁血栓。

图3. cTnTR141W转基因小鼠死亡率分析

注：SPSS16.0软件Kaplan-Meier curves分析cTnTR141W转基因小鼠死亡率。

2.cTnTR141W转基因小鼠表现为进行性心室扩张和收缩功能下降，至4月龄时LVESD和LVEDD分别增加了58.3%和27.8%，而EF%和FS%分别降低了39.9%和45.4% （表1）。

表1. 4月龄cTnTR141W转基因小鼠超声参数

注：Body wt: 体重; HR: 心率; LVESD: 左室收缩末期内径; LVEDD:左室舒张末期内径; LV systolic volume: 左室收缩末期容积; LV diastolic volume: 左室舒张末期容积; EF%: 射血分数; FS%: 短轴缩短率. *P <0.05versus Wild typemice; **P <0.01versus Wild typemice.

3cTnTR141W转基因小鼠心肌细胞排列不齐，间质纤维化增加（图4），透射电镜结果显示cTnTR141W转基因小鼠心肌细胞出现断裂溶解，肌浆网扩张，线粒体肿胀，出现空泡（图5）。

图4. cTnTR141W转基因小鼠心脏整体及心肌显微结构分析

注：同窝阴性对照（A，C）及cTnTR141W转基因小鼠（B，D）心脏整体结构观察；同窝阴性对照（E，G）及cTnTR141W转基因小鼠（F，H）心肌H&E和Masson染色。

图5. cTnTR141W转基因小鼠心肌超微结构分析

注：透射电镜观察同窝阴性对照（A）及cTnTR141W转基因小鼠（B）心肌超微结构，Mf (myofrils): 肌纤维。

4.cTnTR141W转基因小鼠心肌肥厚标志物nppa，nppb，acta1，atp2a2的表达显著增高（图6）。

图6. cTnTR141W转基因小鼠心肌肥厚标志物表达分析

注：NPPA: 心钠肽; NPPB: 脑钠肽; ACTA1:α1肌动蛋白; ATP2A2:钙离子转运ATP酶A2.