H3N2流感小鼠模型

小鼠由于繁殖周期短、遗传背景均一、个体差异小等优点，被广泛用作流感病毒研究的动物模型，流感病毒在小鼠体内能否易感与相应受体有关。实验室所用的近交系和杂交系小鼠的呼吸道虽然都有所表达α-2,3和α-2,6两种唾液酸受体，但其中α-2,3交联唾液酸受体的数量占有优势。根据细胞表面受体分布的特点，小鼠通常只对禽流感病毒易感。而一些研究表明，小鼠能够突破受体限制性，对绝大多数的人流感、猪流感都能感染成功，但具有α-2,6交联唾液酸受体结合偏嗜性的野生型季节性流感病毒H3N2并不能直接成功感染小鼠。季节性流感病毒H3N2野生株虽不能直接感染小鼠，但国际上已建立有H3N2流感病毒小鼠感染模型，其大部分采用的是建立鼠适应株、反向遗传学技术构建整合毒株的方式，即从对病毒进行不断改造的角度进行构建。

病毒株为季节性流感病毒A/Aichi/2/68/H3N2经过小鼠体内7次传代后所获得鼠肺适应株，BALB/c小鼠经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒，小鼠感染后观察14天，监测存活率及体重变化率。感染后分时间段安乐小鼠，分别在0、3、5d采血分离血清并收集肺泡灌洗液进行细胞因子检测；不同时间点取小鼠肺、脾、脑、心等组织，进行病毒滴度测定和组织病理学检查。

1. 小鼠模型感染病毒后临床症状变化

小鼠感染病毒后，感染后的临床表现为：感染后的第3天，小鼠开始出现了弓背、竖毛、蜷缩、行动迟缓等一系列的症状表现，如图1所示。

图1 小鼠感染病毒后临床表现

感染后小鼠出现明显的体重下降，在感染后的第9天内，小鼠全部死亡，体重下降率接近30%，小鼠存活率和体重变化率见图1、2。

图1 H3N2感染小鼠的生存率（n=10）

图2H3N2感染小鼠的体重变化率（n=10）

2.小鼠模型感染病毒后在各组织中的分布及复制动力曲线

在小鼠感染H3N2病毒后第1-9d，安乐死小鼠，检测小鼠的肺、心、肝、脾、肾、肠、脑、眼、气管内的病毒复制情况，结果显示，在感染后不同的天数，肺、心、肝、脾、肾、肠、脑、眼、气管这些组织脏器当中能检测得到病毒载量。在感染后第2-5d肺和气管组织中病毒复制达到高峰，尤其是肺当中最高的滴度达到了105.5TCID50/ml，结果如图3所示。

图3 感染病毒后小鼠不同组织的病毒分布情况 A:不同天数不同组织的病毒载量结果；B：不同天数不同组织的病毒滴度结果

3.小鼠模型感染病毒后组织病理改变

小鼠感染病毒后，分不同天数安乐死小鼠，取组织检测病理改变，结果显示，气管、心、肝、肾组织均未发现明显的病理变化。在感染后第1-5 d内，随着感染天数增加，肺组织病变区域逐渐增大，病变愈发严重。在感染后第1d，局部肺泡间隔轻度增宽，少数支气管上皮细胞变性坏死；在感染后第3d，肺泡间隔明显增宽，支气管上皮细胞变性坏死，肺泡内可见少量炎细胞渗出，血管周围水肿，少量出血；在感染后第5d，肺组织呈现间质性肺炎这一病毒感染引起的典型病理改变，肺泡间隔增宽程度增加，部分区域肺泡腔消失，炎细胞浸润，肺泡内可见较多的炎细胞及浆液纤维素渗出，支气管上皮细胞变性坏死，血管扩张充血；在感染后第7d，肺组织病变略有减轻，结果如图4所示。

免疫组织化学结果与HE染色结果大体一致。结果显示，在感染后第1-5 d内，抗原颗粒随着感染天数呈现增加的趋势。在感染后第1d，支气管上皮细胞呈现轻度阳性；在感染后第3d，支气管上皮细胞阳性增强，肺细胞内巨噬细胞呈现轻度阳性；在感染后第5d，支气管上皮细胞、肺细胞内巨噬细胞呈现出强阳性；在感染后第7d，支气管上皮细胞、肺细胞内巨噬细胞阳性程度降低，结果如图4所示。

图4小鼠感染病毒后肺组织病理学检测（HE，IHC，×200，n=3）

4.小鼠模型感染病毒后细胞因子变化

小鼠感染病毒后，分别在感染后第3d和5d采血分离血清并收集肺泡灌洗液，利用微量样本多重蛋白定量技术（Cytometric Bead Array,CBA）对样本中炎性细胞因子的表达水平进行检测。结果发现，小鼠的血清内IL-1β、MCP-1、IL-1α、GM-CSF的表达升高。在病毒感染后第5天血清内IFN-γ的表达明显增加，结果如图5所示。

图5 感染病毒后小鼠血清细胞因子变化

小鼠肺泡灌洗液中细胞因子IL-1α、IL-6、IL-5、TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达明显升高，同时趋化因子MCP-1、GM-CSF的表达增加，尤其是MCP-1分泌水平急剧升高，并在感染后3天达到分泌高峰，结果如图6所示。

图6 感染病毒后小鼠肺泡灌洗液中细胞因子变化