PUMC01(SARSCoV)滴鼻途径感染Lewis大鼠模型

2023-12-21 15:30:41

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摘要：2002年在中国广东爆发的严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）波及全世界34个国家。2003年4月16日，世界卫生组织根据包括中国内地和香港地区，加拿大、美国在内的11个国家和地区的13个实验室通力合作研究的结果，宣布重症急性呼吸综合征的病因是一种新型的冠状病毒，称为SARS冠状病毒。SARS早期(1~3d），不断释放到血液中SARS-CoV，引起病毒血症。临床上，表现为发热、畏寒、头痛、肌痛等症状。从SARS疾病的起始，淋巴细胞就受到了SAR
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CSTR:16397.09.0C02000018

资源中文名称

PUMC01 (SARS-CoV)滴鼻途径感染Lewis大鼠模型

资源英文名称

PUMC01 (SARS-CoV) virus intranasally infected Lewis rat model

疾病概述

2002年在中国广东爆发的严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）波及全世界34个国家。2003年4月16日，世界卫生组织根据包括中国内地和香港地区，加拿大、美国在内的11个国家和地区的13个实验室通力合作研究的结果，宣布重症急性呼吸综合征的病因是一种新型的冠状病毒，称为SARS冠状病毒。SARS早期(1~3d），不断释放到血液中SARS-CoV，引起病毒血症。临床上，表现为发热、畏寒、头痛、肌痛等症状。从SARS疾病的起始，淋巴细胞就受到了SARS-CoV的侵袭，因此，患者的外周血淋巴细胞数目减少是诊断SARS的重要指标。SARS轻症患外周血CD3+、CD4+、 CD8+数恢复正常；重症患者呈持续下降。所有死亡SARS患者尸解标本中，脾、淋巴结、扁桃体和肠道的淋巴组织萎缩，淋巴细胞大量减少，呈现出耗竭状态。在数周到2个月时间内，SARS-CoV对重症SARS患者免疫器官的损伤程度达到了艾滋病晚期水平。由于患者发生免疫缺陷，因此，发生机会性感染的发病率在本组病例中高达50%。陷窝蛋白-1在呼吸道上皮细胞内高表达，SARS-CoV感染造成多组织脏器损伤，以肺损伤最突出。初始在肺组织中复制增值的SARS-CoV、经血重新进入肺的SARS-CoV和渗出到肺组织中的淋巴细胞、单核细胞本身携带的SARS-CoV在肺内聚积、增殖，不断加重肺损伤。这种损伤具有连续性、弥漫性、严重性的特点，导致广泛性肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，大量蛋白性液体、纤维蛋白、炎症细胞渗出和炎症介质的过量释放，造成了肺内毛细血管的通透性显著增加，最后引起弥漫性肺泡损伤（diffuse alveolar damage, DAD）发生。此时，疾病陷入进展期（4~9d）。在进展期，与肺部的病理改变相对应，患者出现咳嗽、气促、胸闷和呼吸困难等呼吸系统症状。X线检查，肺内早期病变是两肺下野出现斑片状阴影。病情继续发展，到达极期（10~14d），患者出现严重呼吸困难，甚至发生急性呼吸窘迫综合征。X线下，进展期和极期病变迅速发展为两肺广泛病变，呈现弥漫分布斑片状渗出阴影，伴有磨玻璃阴影、边界模糊结节状实变影。

实验动物背景信息

Lewis大鼠：来源于Wistar原种，最先由Lewis繁殖，1954年Aptekman和Bogden繁殖到20代，到1958年Silvers繁殖到31代。①毛色：白化(a，h，c)。②免疫：接种豚鼠髓磷脂碱蛋白后，对实验过敏性脑脊髓炎敏感。极易感染诱发自家免疫性心肌炎。对诱发自家免疫性复合性肾小球肾炎敏感(这与主要组织相容性复合物有关)。易感染实验过敏性脑炎和药物诱发的关节炎。③生理学：血清甲状腺素高，血清胰岛素和血清生长激素高。动物的肥胖取决于饮食的高脂肪物的含量。雌鼠乙基吗啡的肝脏代谢率高。④肿瘤：常见淋巴瘤，肾肉瘤，纤维肉瘤 MC-39，ML-1，ML-7，Lewis10瘤和Lewis3肉瘤。⑤饲养繁殖：易驯养，繁殖率高。2年龄大鼠的存活率为26％。

模型制作方法

SARS-CoV病毒株为PUMC01（Sino-1, GenBank Acc. #; AY350750），分离自一个死于北京协和医院的典型的SARS患者（PUMCH）。SARS-CoV PUMC01病毒通过滴鼻方法感染动物。Lewis大鼠分成4周龄和7周龄两个年龄组，每个年龄组又根据感染病毒剂量的不同，分为高剂量组和低剂量组。动物安乐死后，取肺、脾、肝、肠淋巴结和血液样品进行病毒拷贝数和病毒滴度检测。感染后第7、14、21、28天检测SARS-CoV的IgG抗体动物安乐死后，感染后3，6，9，12和15天取肺、肝、脾、肾和肠淋巴结组织进行病理检查和病毒载量以及滴度检测。

模型表型数据

1.大鼠感染后病毒在组织中复制情况

Lewis大鼠分别在感染后第3，6，9，12和15天被处死，取肺、肝、脾、肾、血、肠系膜淋巴结，用病毒分离和RT-PCR方法检测病毒复制情况。在感染Lewis大鼠的肺、肝、血中可以分离到病毒，以RT-PCR病毒检测结果判定，Lewis大鼠在感染后的12天之内，感染的24只大鼠均为阳性，感染率为100%，对照组病毒分离和RT-PCR的结果均为阴性（表1）。

表 1 SARS-CoV 在Lewis大鼠组织中复制

大鼠	组织	3天	6天	9天	12天	15天	N=
大鼠		RT-PCR/ 病毒分离	RT-PCR/ 病毒分离	RT-PCR/ 病毒分离	RT-PCR/ 病毒分离	RT-PCR/病毒分离
Lewis	肺	+/+	+/+	+/-	+/-	-/-	24
Lewis	肝	+/+	+/+	+/-	+/-	-/-	24
Lewis	血	+/-	+/+	+/-	-/-	-/-	24
Lewis	肾	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	24
Lewis	肠淋巴结	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	24

2.大鼠感染后症状改变及血清中SARS-CoVIgG抗体水平

Lewis大鼠的抗SARS-CoV IgG抗体在感染后第28天仍然保持较高的滴度。4-7周龄Lewis大鼠抗体滴度随时间的变化见图1。对照组抗未检测到抗SARS-CoV IgG抗体。

表2：SARS-CoV感染后大鼠的症状及抗体水平

品系

RT-
PCR

病毒分离

抗体

临床

症状

肺部病变

IgG

中和抗体

Lewis

＋

嗜睡、体重减轻

＋

图1测定被感染Lewis大鼠血清SARS-CoVIgGOD值

3.Lewis大鼠感染后组织病理改变

在Lewis大鼠中，脾和肝脏未见明显的病理改变，在肺脏组织中可见明显的肺炎改变。感染Lewis大鼠第3天肺组织呈局限性间质性肺炎改变，表现为局部肺组织间隔增宽，血管充血伴多量以单核细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润，肺泡腔内可见渗出物，肺泡上皮有坏死和脱落。感染第6～9天肺组织间隔明显增宽、融和伴多量炎细胞浸润，肺泡内可见明显的纤维素样渗出及出血，其中还可见较多的泡沫样组织细胞，有的小支气管、小血管周围可见多量炎细胞浸润，支气管腔内可见炎性渗出物，部分支气管上皮损伤脱落。感染第15天肺组织病变区域缩小，增厚的肺间隔内有多量泡沫样组织细胞浸润，未见出血及渗出。感染第21～28天肺组织病变区明显缩小，仅见少许淋巴细胞浸润，肺泡内渗出物消失，纤维结缔组织增生。肝脏及其它脏器未见明显病理变化。对照组动物各脏器未见明显的病理改变，见图2。免疫组化染色的方法显示在感染后第3天和第12天的肺组织中可以检测到SARS-CoV抗原表达，对照组免疫组化结果阴性，见图3。

图2Lewis大鼠肺组织病理变化。(A)正常对照(HE,100×)；（B）肺组织间隔增宽伴单核细胞和淋巴细胞浸润(HE,100×)；（C）和（D）间隔明显增宽，肺泡内可见泡沫样组织细胞(箭头所指) (HE,100×和400×).；（E）部分支气管上皮损伤脱落(HE,100×)；（F）肺泡内可见明显的纤维素样渗出及出血(HE,200×)；（G）肺泡纤维化和增生(HE,200×)。

图3Lewis大鼠肺组织免疫组织化学染色。（A）正常对照(100×); （B）大鼠感染后3天肺组织(200×)；（C）大鼠感染后12天肺组织(200×)。

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