人肝癌BEL7402绿色荧光标记细胞BALB／c裸小鼠肿瘤模型

人肝癌BEL-7402细胞株是1974年从临床肝癌手术标本中获得并建立的，细胞群体倍增时间为20h，细胞形态呈上皮样细胞，在电子显微镜下亦显示上皮细胞所具有的桥粒和张力原纤维，与临床肝癌细胞相似，分瓶培养第4天时，其有丝分裂指数约为7％。BEL-7402细胞的染色体数为不足三倍体，有一个异常的近端着丝点染色体，间接免疫荧光法测BEL-7402细胞内的AFP为阳性反应，LDH同工酶谱显示与成年人肝细胞不同，而与人胚肝及临床肝癌相近。目前国内外学者主要集中于不同抗肿瘤药物体外抗肿瘤作用和机制的研究。

无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地将人结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/c-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/c-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/c-nu/+）。采用BALB/c-nu/+♀与BALB/c-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，每窝平均成活3.62只仔鼠，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15-18g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

4.1细胞培养：Bel-7402细胞为本实验室冻存

4.2构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

图1绿色荧光表达载体的构建

4.3细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染Bel-7402细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2绿色荧光标记的BEL-7402细胞系（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4.4肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。

5.1影像分析

图3 皮下接种BEL-7402-GFP肿瘤生长影像分析

对数生长期的GFP标记Bel-7402肿瘤细胞悬液皮下种于BALB／cA-nu小鼠，分别在接种的7、14、21和28d观察肿瘤的生长情况。从第1周至第4周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大。