小鼠急性结核感染模型（含耐药结核模型）

3.1实验用小鼠的选择：

选择年龄6~8周龄，体重16~20g， SPF级雌性C57BL/6和BALB/c小鼠（提供厂商:中国医学科学院实验动物研究所）。动物使用申请号:中国医学科学院实验动物研究所实验动物管理委员会（批准号：MC—09-2003）。

3.2饲养环境：

动物生物安全3级实验室（ABSL-3）；温湿度范围：18-28℃；相对湿度：40-70％；换气次数：机械送排风；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清洁消毒：用具、笼架等在投入使用前进行消毒；笼具种类及饲育密度：小鼠笼，12只一笼；

3.3饲养条件

中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司小鼠专用饲料,自由采食；垫料为中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司，定期更换；饮水；普通自来水经过高压(121℃,30min)，自由饮用。

3.4实验用小鼠的分组及感染

实验共分为三个大组，第一组为C57BL/6尾静脉注射组、第二组为C57BL/6腹腔注射组和第三组为BALB/c尾静脉注射组，其中每一个大组中分四个小组：正常对照组(生理盐水)、高剂量组（1X106CFU）、中剂量组（1X105CFU）和低剂量组（1X104CFU），每组12只小鼠，共144只小鼠。

3.5感染用菌株

用结核分枝杆菌标准菌株H37Rv株或结核耐药株（内部编号94789）。

3.6观察

小鼠在进入ABSL-3实验室之后,观察4~5天后,进行感染实验。感染后，观察每天感染小鼠的临床症状，并每周称取小鼠体重，观察不同感染方式和不同感染剂量小鼠体重的变化规律。

3.7病理检查和组织荷菌量计数

分别在感染后6周、8周和10周，每组解剖3只小鼠，分别无菌取小鼠1/2脾脏、1/2肺脏，无菌研磨后接种L-J斜面进行结核分枝杆菌的分离培养。并将同一组织的剩余部分固定在10%福尔马林中，进行病理切片。

4.1小鼠体重的变化结果

根据十周连续观察体重后，统计数据可以看出三个实验组中的对照组小鼠体重按照正常的规律增加，即从实验开始的18~20g到感染第10周后的21~22g左右；实验感染小鼠的体重均有不同程度的下降。

感染途径的不同体重变化的情况随之不同，C57BL/J小鼠尾静脉注射组和腹腔注射组的体重均在感染后第7周开始下降，其中尾静脉注射下降幅度较大。BALB/c小鼠体重下降是从感染后第6周开始下降。

感染剂量的不同体重变化也有较大的变化，感染剂量为105CFU的小鼠体重变化，C57/BL/J是尾静脉感染后第7周开始有明显下降（约3g左右），C57/BL/J是腹腔感染后体重下降的幅度较小在1g左右，BALB/c小鼠体重下降是从感染后第6周开始下降。感染剂量为104CFU、103CFU体重还是在上升，与对照组比较没有明显区别。

体重变换曲线见图1、2：

图1 C57BL/6小鼠尾静脉注射感染结核分枝杆菌后体重变化曲线

图2BALB/c小鼠尾静脉注射感染结核分枝杆菌后体重变化曲线

4.2小鼠感染后大体病理变化

感染后6周解剖时病理变化，与对照组相比，各组小鼠的脾脏肺脏均没有眼观变化。

小鼠在感染8周时，不同品系小鼠和不同剂量组的小鼠在肺脏和脾脏均有不同程度的眼观病理变化。解剖发现主要在肺脏有不同程度秫米大小的结核病灶，且脾脏肿大。小鼠感染8周后解剖病理变化：BABL/c和C57BK/J对照组小鼠均未发现肉眼可见的病理变化。BABL/c和C57BK/J小鼠的尾静脉注射组均有肉眼可见病变灶。C57BK/J小鼠的腹腔注射组没有肉眼可见的病理变化。8周时，与对照组相比，BABL/c小鼠的低剂量组103、104、105肺脏均已经有病理变化，脾脏出现肿大; C57BK/J小鼠低剂量组没有变化，104、105肺脏均有病理变化，且脾脏没有变化。

小鼠感染10周后解剖病理变化：BABL/c和C57BK/J对照组小鼠均未发现肉眼可见的病理变化。与对照组相比，BABL/c和C57BK/J小鼠的尾静脉注射组103、104、105均有肉眼可见病变灶。C57BL/J小鼠的腹腔注射组在10周时也出现了肉眼可见的病理变化。10周时，与对照组相比，BABL/c小鼠的103、104、105各剂量组肺脏均已经有严重的病理变化，有粟粒样结核结节且主要特点是分布在全肺不同的部位，脾脏出现肿大也是一个主要的病理变化指标；C57BL/J小鼠103、104、105肺脏也均出现了病理变化，也有粟粒样结核结节，但主要分布在肺叶的边缘。脾脏与对照组相比，没有明显的变化。

结果见图3、4：

图3对照组小鼠解剖眼观肺脏病理变化

CW:c57小鼠 BW:BABL/c

图4 C57BL/6小鼠尾静脉注射感染结核分枝杆菌后解剖眼观肺脏病理变化

4.3小鼠的组织病理变化

正常对照组的肺脏和脾脏未见明显病理改变。104CFU、105CFU、106CFU组内均有不同程度肺组织内血管旁淋巴细胞浸润，肺组织内肉芽肿，脾脏肉芽肿，肝组织内肉芽肿。结果见图5：

图5 小鼠病理切片HE染色结果
A:正常肺脏；E:正常脾脏；B:肺组织内血管旁淋巴细胞浸润C: 肺组织内肉芽肿；F: 脾脏肉芽肿；G: 肝组织内肉芽肿

4.4 小鼠荷菌量变化

感染后6周时，解剖小鼠肉眼观察，脾脏、肺脏均没有明显肉眼可见的病变灶。每组的正常对照组均无结核分枝杆菌生长，对照组实验结果成立。6周解剖脾脏细菌分离培养均有结果（除去C57BL/J小鼠腹腔注射104有一只为阴性）。证明以103为感染剂量尾静脉注射均可在6周时感染BABL/c、C57BL/J小鼠。脾脏细菌分离培养结果见下表1：

感染后8周时，解剖后对照组小鼠肉眼观察，脾脏、肺脏均没有明显肉眼可见的病变灶，每组的正常对照组均无结核分枝杆菌生长，对照组实验结果成立。但8周解剖时，在C57BL/J尾静脉注射组104、105组已经在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化，BABL/c小鼠尾静脉注射组103、104和105组均在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化。但8周解剖脾脏细菌分离培养均有结果（除去BABL/c小鼠尾静脉注射104和C57BL/J腹腔注射组103各有一只为阴性）。证明以103为感染剂量尾静脉注射均可在8周时感染BABL/c、C57BL/J小鼠，腹腔注射可感染BABL/c小鼠。细菌分离培养显示组织荷菌量高于6周。

感染后10周时，解剖后对照组小鼠肉眼观察，脾脏、肺脏均没有肉眼可见的病变灶，每组的正常对照组均无结核分枝杆菌生长，对照组实验结果成立。在C57BL/J尾静脉注射组104、105、106组已经在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化，BABL/c小鼠尾静脉注射组104和105、106组均在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化，C57BL/J腹腔注射组104、105、106组已经在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化。细菌分离培养结果显示组织荷菌量高于8周。

表1小鼠感染结核分枝杆菌后6周脾脏细菌的分离培养结果